干扰载体构建SOPWord格式.docx

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●克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。

随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子；

●两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；

●StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因；

●在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；

●shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。

如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G；

●ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。

不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。

其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。

在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'

TCAAGAG3'

序列最为有效（AMBIONuse）；

●5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录（stop）；

●在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的提前终止；

●从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'

端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。

正义链和反义链都采用这19个碱基（不包括AA或者NA重复）来设计。

图1RNAi原理

图2shRNA示意图图3shRNA作用原理

4）shRNA设计举例

●以人源基因VEGFC为例，选取干扰靶点序列为：

GCCGATGCATGTCTAAACT

●在该序列两端加上酶切位点，中间插入Loop环，设计shRNA片段：

BamHI靶点序列环结构靶点反义序列HindIII

GATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA

GCGGCTACGTACAGATTTGAAAGTTCTCTTCAAATCTGTACGTAGCCGAAAAAATTCGA

●正反向Oligo序列分别为：

H-VEGFC-sh-F:

5’-GATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA-3’

H-VEGFC-sh-R:

5’-AGCTTAAAAAAGCCGATGCATGTCTAAACTTCTCTTGAAAGTTTAGACATGCATCGGCG-3’

将该Oligo片段正反向一起混合退火后，即可直接与载体进行连接，构建shRNA干扰载体。

第二部分干扰载体pRNAT-U6.1概述

实验名称

shRNA干扰载体构建SOPS2：

干扰载体pRNAT-U6.1概述

起草人／修订人

何章荣

修订日期

2015.7

审核人

审核日期

批准人

批准日期

颁发部门

了解干扰载体pRNAT-U6.1的特点

2.pRNAT-U6.1载体概述

●带有U6启动子，保证shRNA的高表达；

●带有GFP标签，可用于检测转染效率；

●带有多克隆位点；

●带有新霉素（Neomycin）抗性，可用于筛选稳定细胞株

3.pRNAT-U6.1载体图谱

图1pRNAT-U6.1载体图谱

第三部分酶切与回收

shRNA干扰载体构建SOPS3：

酶切与回收

通过酶切可以获得带酶切位点的线性化质粒载体，使用试剂盒对其进行回收。

2.试剂与材料

名称

公司

货号

限制性切酶

Thermo

1.5mLtube

Axygen

0.2mLPCRtube

CyclePureKit

OMEGA

D6492-01

3.仪器与设备

MAXYGENEThermalCycler

MaxyGeneGradient

移液器

大龙

掌上离心机

其林贝尔

LX-200

恒温水浴锅

精宏

DK-80

4.操作步骤

4.1酶切

以Thermo切酶为例，准备好冰盒，将所需试剂从冰箱中取出后置于冰上，待试剂融化后，在0.2mL离心管中加入：

10×

bufferTango5μL

切酶HindIII1μL

切酶BamHI1μL

shRNA干扰质粒pNAT-U6.11μg

ddH2Oupto50μL

盖紧管盖，离心15s。

将0.2mL离心管置于离心管架上，放入37℃水浴锅中，酶切1h（时间长短根据酶的反应效率而异，可参考产品说明书）。

也可以直接使用PCR仪进行酶切反应。

Notes:

●根据酶的特点，可能要求用到BSA，可根据说明书进行操作。

双酶切时，如果仅其中一种酶需要用到BSA，则也需要在酶切体系中加入BSA，因为BSA不会影响切酶的活性。

●若两个位点的切酶使用相同缓冲液（即在该种缓冲液里酶活性最高），可加入两种酶同时进行反应

●若使用不同缓冲液，则可先进行单酶切，回收后再进行第二次酶切，再次回收。

●由于载体上的两个酶切位点一般相距较近，有些酶需要更多的保护碱基，则同时进行双酶切可能效率不高。

可先加入需要更多保护碱基（或是酶切效率较低）的切酶，反应结束后回收（如果两种酶使用同一类缓冲液，则可省去回收步骤），再加入第二种酶进行反应。

酶切后的载体通过凝胶电泳分离然后回收纯化，去除切割下来的小片段，从而降低假阳性。

4.2酶切产物回收

以OMEGACyclePureKit试剂盒为例。

1）将酶切产物转移至1.5mL离心管，加入4-5倍酶切产物体积的BufferCP；

如果PCR片段长度小于200bp，则加入6倍体积的BufferCP；

2）漩涡震荡混匀，短暂离心，收集管壁上的液体；

3）将混合物加入至试剂盒提供的HiBindDNA吸附柱，10000g，室温离心1min；

4）弃残液，加入700μLDNAWASHBuffer，10000g，室温离心1min；

5）重复步骤4；

6）弃残液后，13000，室温离心2min；

7）将HiBindDNA吸附柱置于干净的1.5mL离心管，加入15-30μLElutionBuffer或ddH2O，室温放置1-2min，13000，室温离心2min，收集DNA产物。

第四部分退火与连接

shRNA干扰载体构建SOPS4：

退火与连接

将单链的shRNA上下游片段进行退火，形成双链DNA片段，随后连接至酶切后的载体。

2.试剂与材料：

5×

退火缓冲液

自制

shRNAOligo片段

华大基因

ddH2O

0.2mLPCRTube

pRNAT-U6.1/Neo质粒载体

金斯瑞

T4ligase

康为生物

CW0805

离心机

PICO17

4.1退火

1）按下表配制5×

退火缓冲液：

成分

终浓度

Tris

50mM（pH8.0）

NaCl

250mM

EDTA

5mM

2）将合成好的Oligo片段用蒸馏水溶解稀释至100μM，在0.2mL离心管中按下表加入各成分：

OligoF（100μM）

4μL

OligoR（100μM）

2μL

3）一共10μL，短暂离心后将液体收集至管底，放入PCR仪中，执行以下程序：

95℃5min

80℃4min

75℃4min

70℃4min

65℃2min

60℃2min

55℃2min

50℃2min

45℃2min

40℃2min

37℃2min

20℃20min

程序结束后，可4℃短时间保存，或-20℃长期保存。

4.3连接

由于shRNA片段已带有酶切后的粘性末端，故可直接与酶切后的载体进行连接。

退火后的混合物稀释10倍，使用1~10μL移液枪在0.2mL离心管中加入：

10×

buffer1μL

T4DNAligase0.1μL

退火混合物（已稀释10倍）1μL

酶切后载体pRNAT-U6.13μL

H2Oupto10μL

一共10μL，轻微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s，PCR仪上22℃反应30min。

第五部分转化与涂平板

shRNA干扰载体构建SOPS5:

转化与涂平板

将连接好的质粒转化大肠杆菌，然后涂平板进行筛选。

DH5α

博迈德

琼脂糖

Biowest

琼脂粉

BIOSHARP

氨苄青霉素

胰化蛋白胨

OXOID

L42

酵母提取物

LP0021

汇虹

一次性使用培养皿

堰市为尔康医用品公司

恒温摇床

浦东物理化学仪器厂

THZ-92C

净化工作台

净化

SW-CJ-2D

磁力加热搅拌器

湘仪

78-1

4.1配制LB培养基

♦液体LB培养基：

在大烧杯中加入900ml去离子水，称取以下试剂加入烧杯中：

胰化蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl10g

用搅拌器搅拌混匀，直至全部溶解。

用去离子水定容至1L，121℃高温蒸汽灭菌20min。

♦固体LB培养基：

配置好液态LB培养基后，加入琼脂粉至终浓度1.5%，121℃高温蒸汽灭菌20min。

4.2转化

插入片段和载体连接后，可直接进行转化。

1）打开水浴锅，调至42℃。

准备好冰盒，将装有大肠杆菌感受态细胞DH5α（100μL）的1.5mL离心管从-80℃冰箱中取出，迅速置于冰上；

2）待感受态细胞完全融化后，用1~10μL移液枪将10μL连接产物加入1.5mL离心管中，轻微混匀（动作需轻柔），置于冰上30min；

3）将1.5mL离心管置于42℃水浴锅，热激90s，然后迅速取出，置于冰上5min；

4）超净台中操作，在离心管中加入890μL不含抗生素的LB培养基，置于37℃摇床上，200rpm震荡培养45min；

5）超净台中操作，取100μL转化液涂布于含抗生素（如氨卞）的LB平板培养基，置于37℃孵箱，过夜培养。

设置对照：

♦对照A．将双酶切后的载体质粒直接进行连接反应（不加插入片段），然后进行转化。

这个对照可检测双酶切是否完全。

如果长出克隆，说明双酶切不完全，部分质粒完全没有酶切或只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切完全。

♦对照B．载体双酶切后，不进行连接反应，直接进行转化。

如果长出克隆，说明有残留的未被任何酶切的原始质粒。

♦对照C：

将未酶切的原始质粒直接进行转化，验证转化过程的正确性。

如果长出大量克隆，说明转化成功，否则视为转化失败。

♦对照D：

取20μL感受态细胞直接涂布于不含有抗生素的LB平板上，检测感受态细胞的活性。

如果长出大量克隆，说明感受态细胞活性好。

4.3涂平板

1）倒平板：

将装有固体LB培养基的三角瓶（去掉封口膜）放入微波炉，加热使培养基融化，取出后冷却至55℃左右（手可触摸），在超净台操作，加入抗生素（如氨苄青霉素，终浓度100μg/mL），并充分摇匀。

将培养基分装倒入一次性细菌培养皿，每个约10mL，室温冷却凝固。

可将培养皿用parafilm封口后，倒置放入4℃冰箱保存备用。

2）用移液器吸取100μL菌液滴至固体培养基表面，用弯曲的玻璃棒（事先酒精灯灼烧后冷却）将菌液涂布均匀，待菌液吸收干燥后，将培养皿置于37℃恒温箱，倒置培养（倒有培养基的一面在上）。

以上需在超净工作台中操作，实验结束后及时清理工作台面。

倒平板时，一定要在培养基冷却后再加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效。

第六部分挑菌与菌液PCR

shRNA干扰载体构建SOPS6:

挑菌与菌液PCR

1.目的

挑取菌落克隆培养，用菌液直接进行PCR，鉴定目的片段是否已插入载体。

HSMix

东盛生物

P2082

DNAmarker

1.挑菌

1）待平板的菌落长至足够大达到可挑的水平（肉眼可见，直径约0.5mm以上）；

2）准备好若干个1.5mL离心管，各加入500uL含抗生素的LB培养基；

3）用镊子夹取灭菌的牙签（或10μL枪头）挑取平板上的单菌落，在离心管的培养基中蘸洗几下，盖紧管盖后再将牙签丢弃于台外的收集箱中（若用10μL枪头，可将枪头留在离心管）；

4）接种过菌落的离心管在37℃摇床中振荡培养，摇速250rpm；

注意试管要在摇床上放好，有适当的倾斜角度（45°

左右）。

2.菌液PCR

1）挑取菌落在37℃摇床培养4-5h至培养基呈浑浊状后，将离心管取出，取1μL；

2）在0.2mL离心管中加入：

HSPCRmix10μL

Forwardprimer（10uM）1μL

Reverseprimer（10uM）1μL

菌液1μL

ddH2O7μL

3）一共10uL，轻微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s。

打开PCR仪，将离心管置于PCR仪上，盖紧保护盖，PCR程序设置如下：

95℃10min

30cycles

95℃30s

55℃30s（退火温度根据引物Tm值不同而定）

72℃30s（延伸时间随目的产物长度及酶的合成效率不同而定）

72℃7min

4）PCR程序结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，有目的条带的克隆即可送公司进行测序鉴定。

测序正确则说明载体构建成功，可将该克隆扩大培养，提取质粒，以待后续试验使用。

第七部分质粒提取

shRNA干扰载体构建SOPS7:

质粒提取

从菌液中提取质粒，以供下游实验（酶切，转染等）使用。

高纯度质粒小提中量试剂盒

天根生物

DP107

无毒素质粒大提试剂盒

DP117

异丙醇

无水乙醇

50ml离心管

Amresco

0339

高速冷冻离心机

H2050R

4.1质粒小提

以天根公司试剂盒“高纯度质粒小提中量试剂盒（DP107）”为例：

1）柱平衡步骤：

向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×

g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）

2）取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm（~13,400×

g）离心1min，尽量吸除上清。

注意：

菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。

3）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4）向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。

此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。

如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5）向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12,000rpm（~13,400×

g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6）将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12,000rpm（~13,400×

g）离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；

如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清）。

7）12,000rpm（~13,400×

g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12,000rpm（~13,400×

g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

8）向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×

加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5min，有助于更好地去除杂质。

9）重复操作步骤9。

10）将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12,000rpm（~13,400×

g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11）将吸附柱CP4置于一个干净的