生物技术制药知识点总结1Word格式文档下载.docx
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生物技术药物的特性是什么?
生物技术药物的特征是:
(1)分子结构复杂
(2)具有种属差异特异性
(3)治疗针对性强.疗效高
(4)稳定性差
(5)免疫原性
(6)基因稳定性
(7)体内半衰期短
(8)受体效应
(9)多效应和网络效应
(10)检验特殊性
生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品
(1)传统生物技术的技术特征是酿造技术,所得产品的结构较为简单,属于微生物的初级代谢产物。
代表产品如酒.醋.乙醇,乳酸,柠檬酸等。
(2)近代生物技术阶段的技术特征是微生物发酵技术,所得产品的类型多,不但有菌体的初级代谢产物.次级代谢产物,还有生物转化和酶反应等的产品,生产技术要求高.规模巨大,技术发展速度快。
代表产品有青霉素,链霉素,红霉素等抗生素,氨基酸,工业酶制剂等。
(3)现代生物技术阶段的技术特征是DNA重组技术。
所得的产品结构复杂,治疗针对性强,疗效高,不足之处是稳定性差,分离纯化工艺更复杂。
代表产品有胰岛素,干扰素和疫苗等。
新型生物反应器有:
1.气升式生物反应器
2.流化床式生物反应器
3.固定床式生物反应器
4.袋式或膜式生物反应器
5.中空纤维生物反应器
生物技术药物分类
1.重组DNA技术制造的多肽、蛋白类药物
2.基因药物,包括基因治疗药、基因疫苗、反义药物、核酶
3.来自动、植物、微生物的天然药物4.合成与半合成的生物药物
按照医学用途分类:
1.治疗药物,治疗疾病是生物药物的主要功能。
2.诊断药物,具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。
3.预防药物,对于许多传染性疾病来说,预防比治疗更重要。
生物技术药物的特性
1.分子结构复杂2.具有种属特异性3.治疗针对性强,疗效高4.稳定性差5.基因稳定性6.免疫原性7.体内t1/2短8.受体效应9.多效性和网络性效应10.检验的特殊性
生物技术制药的特征1.高技术:
高知识人才,高技术手段2.高投入:
1~3亿美元/药3.长周期:
8~10年/药4.高风险:
成功率5~10%5.高收益:
回报率10倍
生物技术制药分为哪些类型?
生物技术制药分为四大类:
(1)应用重组DNA技术(包括基因工程技术.蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽,蛋白质类治疗剂。
(2)基因药物,如基因治疗剂,基因疫苗,反义药物和核酶等
(3)来自动物.植物和微生物的天然生物药物
(4)合成与部分合成的生物药物
生物技术在制药中有那些应用?
答案:
生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治人类重大疾病及疑难症的新型药物,具体体现在以下几个方面:
(1)基因工程制药,利用基因工程技术可生产出具有生理活性的肽类和蛋白质类药物,基因工程疫苗和抗体,还可建立更有效的药物筛选模型,改良现有发酵菌种,改进生产工艺,提供更准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。
随着基因技术的发展,应用前景会更广阔。
(2)细胞工程和酶工程制药
该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技术手段,使人类可控制或干预生物体初次生代谢产物和生物转化等过程,使动植物能更有效的满足人类健康方面的需求。
(3)发酵工程制药
发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改进,新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。
第一节基因的概念与特性
一、基因的概念:
DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。
二、基因的一般特性:
①基因可自我复制,②基因决定蛋白质结构,③基因可突变。
基因按功能分为:
①结构基因②调控基因
三、DNA的结构与性能⒈DNA的结构:
四种核苷酸(ATCG)连接一级结构、DNA二级结构(α,β),双螺旋结构。
⒉DNA的性质与功能:
①吸收光谱260②电场中泳动③变性、复性、杂交
第二节DNA的复制与表达
二、基因表达⒈转录:
在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2.翻译:
以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程。
(1)分为三个阶段:
①起始②延长③终止
(2)翻译后的肽链加工:
①羟基化②糖基化③磷酸化④乙酰化
第二章基因工程制药
第一节概述
医用活性蛋白和多肽类包括:
①免役性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体。
②细胞因子,如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。
③激素,如胰岛素、生长激素、心钠素。
④酶类,如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物岐化酶等。
基因工程技术生产药品的优点
1.利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽(如胰岛素、干扰素、细胞因子等),为临床使用建立有效的保障。
2.可以提供足够数量的生理活性物质,以便对其生理、生化和结构进行深入的研究,从而扩大这些物质的应用范围。
3.利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。
4.内源生理活性物质在作为药物使用时,存在不足之处,可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造。
5.利用基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。
第二节基因工程药物生产的过程
基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体,拼接后转入新的宿主细胞,构建成工程菌(或细胞),实现遗传物质的重新组合,并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程药物:
系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质,然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成,利用重组DNA技术加以改造,最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖,并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质,通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。
基因工程药物制药的主要程序(步骤)⒈目的基因的克隆⒉构建DAN重组体⒊DAN重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等
基因工程药物制药的主要程序
获得目的基因→组建重组质粒→构建工程菌(或细胞)→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装
基因工程的单元操作顺序是酶切,连接,转化,筛选,验证
阐述基因工程药物研制有那些主要过程?
(1)基因工程药物的生产必须首先获得目的基因,然后用限制性内切酶和连接酶将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌(细胞),以便大量复制目的基因。
对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。
(2)目的基因获得后,最重要的就是使目的基因表达。
基因的表达系统有原核生物系统和真核生物化的难易。
将目的基因与表达载体重组,转入合适表达系统,获得稳定高效表达的基因工程菌(细胞)。
(3)建立适于目的基因高效表达的发酵工艺,以便获得较高产量的目的基因表达产物。
(4)建立起一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。
第三节目的基因的获得
克隆真核基因常用方法:
逆转录法和化学合成法。
一、逆转录法:
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达。
⒈mRNA的纯化⒉cDNA第一链的合成⒊cDNA第二链的合成⒋cDNA的克隆⒌将重组体导入宿主细胞:
⒍cDNA文库的鉴定:
抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定:
核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法
三、化学合成法:
较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。
必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。
再按相应的密码子推导出DNA的核甘酸序列。
用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段,再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段,然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段,再用连接酶连接成完整的基因。
人工化学合成基因的限制有:
⒈不能合成太长的基因目前DNA合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为50~60bp,因此只适用于克隆小分子肽的基因。
⒉遗传密码的简并使选择密码子困难,用氨基酸顺序推测核苷酸序列,得到的结果可能与天然基因不完全一致,易造成中性突变。
⒊费用高。
四、基因筛选的新方法1.编码序列富集法2.岛屿获救PCR法3.动物杂交法4.功能克隆法5.构建cDNA文库6.差异显示技术的应用
五、对已发现基因的改造应用基因修饰技术和点突变技术提高目的基因表达产物的稳定性、t1/2、提高表达量,降低毒性或免疫原性。
第四节基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下外源基因片段,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
最佳的基因表达体系:
;
目的基因的表达产量高;
表达产物稳定;
生物活性高和表达产物容易分离纯化
一、宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:
1.容易获得较高浓度的细胞;
2.能利用易得廉价原料;
3.不致病、不产生内毒素;
4.发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态;
5容易进行代谢调控;
6.容易进行DNA重组技术操作;
7.产物的产量、产率高,产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类:
第一类为原核细胞:
常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等;
第二类为真核细胞:
常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
二、大肠杆菌中的基因表达
载体:
是基因工程的目的和基本手段,是选用合适的载体把供体DNA(外源基因)运载到受体细胞内,从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。
基因工程载体分为:
克隆载体,转录载体,表达载体;
DNA(克隆载体)→DNA(转录载体)→RNA→蛋白质→(表达载体)
原核细胞的基因组特点:
①染色质为环状双股DNA分子②具有操纵子结构③结构基因多为单拷贝④特定区域分布特异DNA顺序,因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段
基因克隆载体1)定义:
基因克隆载体是一类能够承载外源基因并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
2)目前经常使用的载体,有质粒和病毒两类。
各种不同的载体,尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异,但是作为载体,它们应该具备一些共同的特性。
基因工程克隆载体的特点:
①具有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗药基因④拷贝数高⑤生物安全性好
质粒的分类
⒈按复制型式①严紧型②松弛型
⒉按基因转移性①传递性质粒②非传递性质粒
⒊按遗传性状产物分类:
①抗生素抗性②限制酶、修饰酶系统
真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件
⑴载体能够独立复制。
载体本身是一个复制子,具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。
⑶应具有很强的启动子,能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录。
⑸应具有很强的终止子,只转录克隆的基因,所产生的mRNA较为稳定。
⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列,以便转录后顺利翻译。
基因工程药物研制有那些主要过程?
影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
⑴外源基因的拷贝数:
外源基因是克隆到载体上的,因此载体在宿主菌种的拷贝数就直接关系到外源基因的拷贝数。
⑵外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成
⑶表达产物的稳定性:
①组建融合基因,产生融合蛋白;
②利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽,把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中;
③采用位点特异性突变的方法,改变真核蛋白质中二硫键的位置,从而增加蛋白质的稳定性;
④采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌,有可能减弱表达产物的降解。
⑷细胞代谢负荷:
⑸工程菌的培养条件:
外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,必须优化基因工程菌的培养条件,进一步提高基因表达水平。
表达用的酵母菌应满足哪些条件?
答:
表达用的酵母宿主菌应具备①菌体生长力强.②菌体内蛋白酶要较弱.③菌株性能稳定.④分泌能力强。
基因工程宿主菌应满足那些要求?
目前应用最广泛的宿主菌有哪些?
(1)容易获得较高浓度的细胞;
(2)能利用廉价易得的原料;
(3)不致病、不产生内毒素;
(4)发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;
(5)容易进行代谢调控;
(6)容易进行DNA重组技术操作;
(7)产物的产量、产率高,产物容易提取。
宿主菌可分两大类:
1)原核细胞:
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌;
2)真核细胞:
酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。
表达载体须具备哪些条件?
常用载体有哪些?
(1)能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
(2)具多个限制酶切点,但每种切口最好只有1个,以便与外源基因连接。
(3)具有某些标记基因,便于进行筛选。
(4)所产生的mRNA必须有翻译的起始信号。
(5)具有很强的启动子。
(6)有很强的终止子。
(7)常用载体有:
1、细菌细胞的质粒。
2、λ噬菌体载体。
第五节基因工程菌生长代谢的特点
一、菌体的生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分。
碳源物质为细胞提供能量,当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时,菌体会产生乙酸,导致培养基的pH值下降,从而影响菌体的生长。
提高pH,可减少乙酸的抑制作用。
分批培养中选择不同的碳源,连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生,减少它的抑制作用。
加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。
二、菌体生长与前体供应的关系
在基础培养基中加入氨基酸(小分子前体)能使菌体比生长率提高,蛋白合成增加。
基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构,致工程菌生长速率降低。
质粒存在对菌体代谢的影响:
中等拷贝质粒(56拷贝)的工程菌中与前体合成有关的酶增加,这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。
如:
三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。
高拷贝质粒的工程菌(240拷贝)中,生长速率和菌体总蛋白合成均减少。
这与工程菌大量前体被利用引起前体不足,从而产生“严紧反应”有关。
“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。
第六节基因工程菌的不稳定性
质粒不稳定基因工程菌在传代(25代以上)过程中常出现的现象。
分裂不稳定:
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定:
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变
常见分裂不稳定的两个因素:
⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率(质粒丢失率);
⑵这两种菌(含质粒菌和不含质粒菌)比生长速率差异的大小。
二、提高质粒稳定性的方法1.合适的宿主:
宿主菌2.合适的载体:
质粒拷贝数3.选择压力:
抗生素4.分阶段控制培养:
⑴先使菌体生长至一定密度;
⑵再诱导外源基因的表达5.控制培养条件:
温度、pH值、培养基组分、溶氧6.固定化:
卡拉胶
第八节重组工程菌的培养
一、基因工程菌的培养方式:
1分批培养;
2补料分批培养;
3连续培养;
4透析培养;
5固定化培养
2.补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基(溶氧控制、流加补料),使菌体进一步生长的方法。
良好的生长环境,延长对数生长期,获得高密度菌体。
对发酵影响较大的几个因素有:
⒈培养基的影响⒉接种量的影响⒊温度的影响⒋溶解氧的影响⒌诱导时机的影响⒍诱导表达程序的影响7.pH的影响
接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。
最佳化的工艺是获得(七最):
最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果和最低失败率。
第九节高密度发酵
高密度发酵:
培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L(细胞干重/L)以上,最高200gDCW/L
高密度发酵特点:
菌体高密度,总表达量高;
生物反应器体积小;
单位体积生产能力高;
生产周期短,分离成本小
基因工程菌的高密度发酵过程中,目前普遍采用()作为发酵培养基的碳源。
影响高密度发酵的因素1.培养基:
C源、N源种类和含量;
C:
N含量比值;
微量元素;
无机盐(磷影响表达质粒的复制速率)2.溶氧浓度:
空气分离系统提高氧分压;
透明颤菌血红蛋白基因克隆到菌体中,提高氧传质能力;
菌体与小球藻混合培养,藻细胞光合作用产氧供菌体呼吸。
3.pH值:
大肠杆菌产酸、CO2必须加碱调节pH值4.温度:
控制菌体生长,温控诱导表达(诱导时机和持续时间,对数生长期,2min)5.代谢副产物:
C源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能力,产生乙酸,抑制菌体生长和蛋白表达。
采取流加补料法,或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。
二、实现高密度发酵的方法
1.发酵条件的改进
(1)培养基的选择:
(2)建立流加式培养方式;
(3)提高供氧能力2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌
(1)阻断乙酸生产的主要途径:
(2)对碳代谢流进行分流:
(3)限制进入糖酵解途径的碳代谢流;
(4)引入血红蛋白基因。
3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵有什么不同?
简单分析其温度对发酵的影响。
第十节基因工程药物的分离纯化
离子交换层析:
是依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
疏水层析:
是利用蛋白质表面的疏水区域和固定相上疏水基团之间的相互作用力差异,对蛋白组分进行分离的层析方法。
疏水层析的基本原理?
蛋白质表面多由亲水基团组成,也有一些疏水性较强的疏水区。
在高盐浓度时,蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏,暴露出疏水部位,疏水作用增强,与固定相上的疏水基团产生疏水性作用而被吸附;
盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱,目的蛋白质被逐步洗脱下来。
亲和层析的基本原理?
通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质(也称载体)上,利用分子间亲和力的特异性和可逆性,对另一个分子进行分离纯化。
(被固定在基质上的分子称为配体,配体与基质共价结合,构成亲和层析的固定相,称为亲和吸附剂。
)
凝胶过滤层析的优缺点?
优点:
设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性。
缺点:
分辨率较低,尤其是相对分子质量相近的分子之间。
补料分批培养:
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间,间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的培养方法。
促红细胞生长素(EPO)基因能在大肠杆菌中表达,但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素,这是因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化
凝胶过滤法是根据分子大小来分离蛋白组分。
基因工程菌的生长代谢与碳源RNA聚合酶.产物的分子量有关
在工程菌发酵过程中,甘油会对lac启动子有阻遏作用
亲和色谱方法是依据亲和性能来纯化基因工程药物
超声波法不是化学破碎细胞的方法
连续培养:
连续培养是将种子接入发酵反应器中,搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后,开动进料和出料蠕动泵,以一定稀释率进行不间断培养。
分离纯化基因工程药物常用的色谱方法有那些?
它们的原理是什么?
分离纯化基因工程药物常用的色谱方法有:
离子交换色谱,疏水色谱,亲和色谱和凝胶过滤色谱;
离子交换色谱,以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子和交换剂上的平衡离子进行可拟交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种色谱方法;
(1)离子交换色谱IEC:
是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
(2)疏水层析HIC:
是利用蛋白质表面的疏水区与固定相上疏水性基团相互作用力的差异,对蛋白质组进行分离的层析方法。
(3)亲和层析AC:
是利用固定化配体与目的蛋白质之间的非常特异的生物亲和力进行吸附,这种结合既是特异的,又是可逆的,改变条件可以使这种结合解除。
(4)凝胶过滤层析:
以多孔性凝胶填料为固定相,按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。
建立基因工程药物分离纯化工艺时,应该考虑那些因素?