偶氮胂Ⅲ分光光度法测定生物样品血清中的钙Word格式.docx

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关键词：

钙分光光度法偶氮胂血清.

ABSTRACT

Calcium（Ⅱ）reactswithDBM-arsenazotoproducea1:

2（M:

R）bluecomplexinNH3-NH4ClbuffersolutionmediumatpH10.4.Themaximumabsorptionwavelengthofthecomplexlocatesat628nm.Theapparentmolarabsorptivityofthemethodisε628nm＝3.92×

cm-1.Beer’slawisfollowedovertherangeof2～10μgofcalciumin10mLofsolution.Themethodwasusedinthedeterminationofcalciuminbiologicalsamples.Therelativestandarddeviationsofsixreplicatedeterminationswerelessthan2%andtherecoveriesofthestandardadditionwere98.0%～100.5%.

Keywords:

calcium，spectrophotometry，arsenazoⅢ，biologicalsample

摘要……………………………………………………………Ⅰ

ABSTRACT……………………………………………………Ⅱ

第一章分光光度法概述………………………………………1

1.1引言………………………………………………………1

1.2基本原理……………………………………………………1

1.3分光光度分析新方法………………………………………6

1.4分光光度法测定与其他方法联用……………………………9

第二章钙………………………………………………………15

3.1钙的性质……………………………………………………15

3.2钙的应用……………………………………………………15

3.3钙对人体的影响……………………………………………16

3.4钙的生产工艺………………………………………………17

3.3分光光度法测定钙的进展…………………………………18

第三章偶氮胂分光光度法测定生物样品中的钙……………22

4.1前言…………………………………………………………22

4.2实验部分………………………………………………………22

4.3结果与讨论……………………………………………………23

4.4样品分析………………………………………………………28

结论………………………………………………………………31

致谢………………………………………………………………32

参考文献……………………………………………………………33

第一章分光光度法概述

1.1引言

分光光度法是获得物质吸收光特性及定性、定量信息的重要手段，在冶金、地质、生物、医学、农业、环境监测、食品卫生等领域得到了广泛应用[1]。

随着研究的深入，现代光度分析应用范围已从传统的无机分析领域扩大到生命活性物质（核酸、蛋白质、氨基酸等）、环境污染物和形态分析，其中在生物分析方面的应用呈明显上升之势[2]。

目前，在中国国家标准中，光度分析方法超过70种，此外，一些部颁标准或行业标准涉及大量光度法,这些标准的确定极大地推动了光度分析在实际工作中的广泛应用[3]。

1.2基本原理

分光光度法依据的是物质对光的吸收特性[4],1729年和1760年布格（Bouguer）和朗伯（Lambert）先后阐明辐射强度和吸收层厚度的关系，1852年比耳（Beer）又提出辐射强度和吸收物浓度也有类似的关系，布格-朗伯-比耳定律的数学表示式为：

A=log（I0/It）=εbC

式中，A为吸光度，b为吸收层厚度（cm），C为吸收物的摩尔浓度（M），ε为摩尔吸光系数（L·

mol-1·

cm-1）。

此定律应用于紫外－可见－红外光谱区吸收测量[5]，实际应用时，研究吸收与物质浓度的关系更为重要，因而习惯上简称比耳定律。

摩尔吸光系数（ε）在特定波长及溶剂情况下，是吸光分子（或离子）的一个特征常数。

它是物质吸光能力的量度，可作定性分析的参数。

1.2.1灵敏度的表示方法

灵敏度的表示方法一般有三种：

（1）摩尔吸光系数

有色化合物的摩尔吸光系数ε（L·

mol-1·

cm-1），是衡量显色反应灵敏度最重要的指标。

一般认为，ε﹥105的方法是超高灵敏度的方法，ε=（6–10）×

104的方法是高灵敏方法，ε=（2–10）×

104的方法是中等灵敏的方法，而ε＜2×

104则是不灵敏的方法[6]。

（2）比吸光系数α

α值相当于浓度为1mg/L的待测物质溶液，用1cm长的吸收池测得的吸光度，以mL·

g-1·

cm-1表示，α与ε的关系为：

α=ε/原子量×

1000

α值便于比较原子量（式量）不同的物质的显色反应灵敏度[7]。

（3）桑德尔（Sandell）指数s

s值表示用1cm吸收池测得吸光度为0.001时，每毫升溶液中待测物质的微克数，以µ

g·

cm-1表示，s与ε的关系式为：

S=F/ε

式中F表示待测物质的式量。

1.2.2提高分光光度法灵敏度的有效途径

（一）合成新的高灵敏有机显色剂

（1）增大有机显色剂分子的共轭体系

理论已经说明，增大有机显色剂分子的共轭体系，不仅使π电子流动性增大，π→π*跃迁的能量降低，最大吸收峰红移；

电子跃迁的纪律也可能增大，使吸收强度增加；

而且也增大了显色剂分子的有效截面积[8]，从而提高了显色剂的灵敏度。

但是共轭体系也不能无限度扩大，因为分子的共轭体系过大，导致试剂本身的颜色很深，对比度降低，也可能导致分子中某些基团的空间为阻效应破坏分子的平面结构而降低显色反应的灵敏度。

（2）在有机显色剂分子中引入取代基[9]

在有机试剂分子中引入适当的取代基，由于取代基吸电子或给电子性质而产生的电子效应（诱导效应和共轭效应），使分子的电子云密度发生变化，引起试剂分子的酸碱性质，成络能力的变化。

从而提高显色剂的灵敏度

（3）高灵敏显色剂

最近几年发表了许多金属二元配合物的摩尔数达到105数量级的有机显色剂的报告，这些高灵敏有机试剂主要有三中类型：

（1）不对称变色酸双偶氮类试剂；

（2）吡啶及噻唑偶氮衍生物；

（3）卟啉类试剂。

1.2.3多元配合物灵敏显色体系

由三种或三种以上不同组分参与形成的配合物，称多元配合物，由多元配合物显色反应一般都有很高的灵敏度，一方面由于三元或四元配合物分子比相应的二元配合物有更大的分子截面积；

另一方面可能由于第二或第三配位体的引入，引起配位体与配位体之间，配位体与中心金属离子间的协同作用，使有色分子的电子云密度发生更大的变化，共轭ε电子的流动性和电子跃迁几率增大。

周期表中绝大多数元素均可形成多元配合物，从目前情况看，摩尔吸光系数达105以上，较有价值的多元配合物显色体系有5种：

（1）金属－三羟基荧光酮－表面活性剂三元配合物显色体系；

（2）金属－变色酸双偶氮胂衍生物－阳离子表面活性剂显色体系；

（3）混配胶束四元配合物显色体系；

（4）金属络阴离子与碱性染料阳离子形成的离子缔合显色反应；

（5）三元混合配化合物显色体系。

1.2.4改变反应条件以改变反应产物的组成和产率

有色化合物的组成和结构与反应条件有关，如溶液的pH值、介质性质（溶剂性质）及试剂过量程度等。

在显色反应中，有机溶剂的作用主要是与金属离子、显色剂分子、表面活性剂、配合物等发生溶剂化效应或形成氢键，从而抑制金属离子的水解聚合，提高了金属离子的反应活性，有利于使反应向生成配合物方向移动，增加有色配合物的产率，从而提高显色反应的灵敏度。

1.2.5放大反应的应用

所谓放大反应（或倍增反应）是指通过适当的途径使待测组分转变为更有利于测量的等当量物质，是一种间接分光光度法，Belcher等对这类反应的分析应用作过评述，如测定碘化物时，可将I-氧化成碘酸盐，再在酸性溶液中使碘酸盐与KI反应生成I2。

然后使碘与淀粉反应成深色化合物，在590nm处测定，摩尔吸光系数为1.08×

105L·

cm-1。

或者在氧化成I2后，于0.15～0.05mol/LH2SO4中用苯萃取I2—I—孔雀绿缔合物，摩尔吸光系数为2.74×

此类方法可在很多领域中应用[10]。

1.2.6有机试剂和显色反应的选择性

有机试剂的选择性是指在给定条件下，能与某种有机试剂反应的金属离子种类的多少；

某种试剂在一定条件下只能与有限种金属离子起反应，或者在和某种金属离子反应时，可允许共存的其它离子的种类愈多，相对浓度愈大，则称该试剂为高选择性试剂，反之，则是选择性不好的试剂。

试剂的选择性或专属性，取决于试剂本身的结构、性质和反应条件。

（一）有机试剂分子的整体结构对反应选择性的影响

有机试剂研究和在分析上的应用经历了较长的发展过程，早在1928年，Feigl提出了特效基团的概念，认为决定有机试剂与金属离子放映特性的是试剂分子中直接与金属离子作用的原子或原子团，即成盐或配位基团，后来Kyheuob和Kjibepr作了大量补充，总结了20多种元素的分析功能团。

方法日益完善。

（二）配位原子性质及其空间配置对试剂选择性的影响[11]

在鳌合显色反应中，鳌合剂分子中的配位原子通常是指O，S，N，P，As，Se，卤素等，其中最常见的配位原子是O，N，S。

配位原子通常以酸性基团（成盐基团）如-COOH，-OH，-AsO3H2，-PO3H2，=SH等或者配位基团如-N=N-，=N-，=O，=S，-NH-的形式连接在分子的碳骨架上，一个有机试剂分子可以含有一个或者多个同种或不同种的配位原子，各配位原子间应有一个适当的空间位置，以满足与金属离子配位具有反应趋势，可由路易斯酸碱理论予以说明。

在显色过程中，有机试剂分子中的配位原子与金属离子间形成化学键，配位原子把它的一个未共有电子队供给中心金属离子，因此，有机配位体就相当于路易斯碱，而中心金属离子则相当于一个路易斯酸，有机试剂分子中的其余部分可能影响配位原子向金属离子提供电子对的能力，而配位原子又反过来影响分子中的其它部分的性质。

根据软硬酸碱的概念，具有体积小、正电荷多、不易极化、不易失去电子而又容易形成离子键物质，称为“硬酸”。

体积小、正电荷少、易极化、易失去电子而又容易形成共价键的物质则称为“软酸”。

各类酸碱相互作用大致遵循“软亲软”和“硬亲硬”的原则

（三）取代基对试剂选择性的影响

（1）取代基的空间位阻效应

当配位体积较大，又必须有多个配位体与金属离子配位才能满足其配位数的要求时，配位体在中心离子周围的排布就会受到阻碍；

如配位体含有取代基，受阻的情况就会更严重，此时，空间配位阻效应与取代基的体积及分子中所处的位置有关，取代基体积愈大，并处于取代基临位时，位阻效应越大。

（2）取代基增强试剂的酸性

取代基增强试剂的酸性

试剂分子中引入吸电子基，将使分子中的电子云向吸电子基方向移动，导致试剂分子中酸性基团离解度增加，提高了试剂的酸性，螯合显色反应就可以在较强的酸性介质中进行，从而提高了反应的选择性[12]。

1.2.7反应条件对显色反应选择性的影响

（1）反应酸度

大多数显色剂是一中螯合剂，在螯合显色反应中，酸度是形成螯合物的最重要条件，酸度的影响表现为显色剂的酸效应和金属离子水解效应和成络能力随溶液酸度改变，可能导致某种配合物不能形成和产率很底。

同一种显色剂可在不同的酸度下与不同的金属离子反应。

（2）掩蔽剂

在分光光度分析中，加入适当的掩蔽剂，利用金属离子与显色剂、掩蔽剂生成配合物稳定性差异以提高显色反应的选择性，是行之有效的方法。

在选择掩蔽剂时，应依据软硬酸碱规则，并尽可能采用配位体竞争反应。

1.3分光光度分析新方法

新方法的的研究也是光度分析的一个重要内容[13]，近年来出现了许多新方法并得到迅速的应用[14],如浮选技术、多波长及多元回归、流动注射光度法、固相光度法、褪色光度法等。

下面将对动力学光度法、流动注射光度法、固相光度法和计算光度法加以介绍。

1.3.1动力学光度法

动力学光度法是基于显色反应的动力学特性而建立起来的光度分析新方法，包括速差动力学光度法、胶束介质动力学光度法、催化动力学光度法等。

近20多年来发表了不少动力学分析法的研究报告和综述，并出版了专著，在很多的分析化学著作中都列有专章。

与热力学方法相比，动力学具有下述优点[14]：

（1）反应选择性较好，适于混合物中性质十分相似组分的同时测定,如有机化合物中的异构体和同系物等。

（2）催化动力学分析法灵敏度高。

（3）扩大了可利用的化学反应范围，很多反应由于达到平衡很慢，或者平衡常数太小，或者有副反应，而不能采用热力学分析法，但可采用动力学分析法，因为后者并不要求反应完全，只需测定反应起始阶段的数据即可。

（4）由于动力学分析法是以时间为变量的，便于计算机与分析仪器的联机使用，容易实现流程控制、样品检测、数据采集和处理的自动化。

催化动力学光度法因其特有的高灵敏度在光度法中占有重要地位。

近年来，利用催化光度法测定研究呈上升趋势，其涉及的元素有汞、锡、银、铁、铜、锌、钙、锇、铝等,涉及的阴离子有SCN－、BrO3－、NO2－、NO3－。

1.3.2固相光度法

尽管现在已有很多的化学方法和仪器设备可以应用在痕量分析中，但光度分析法因其仪器设备简单和高灵敏度、高选择性显色试剂的不断出现而受到广大分析工作者的青睐。

固相光度法集分离、富集、测试于一体，不仅简化了实验过程，而且灵敏度和选择性比相应的溶液光度法有显著的提高。

固相光度法目前普遍采用的是透射法测量[15-17]，这就要求固相有一定的透光性，对于不透光的固相介质，透射法测量就无能为力了。

以树脂相光度法为例，为了让入射光较好地透过树脂相，比色皿不能太厚,目前大多采用0.5cm比色皿,树脂用量增多会导致灵敏度降低,因此也有人使用制作复杂的1mm比色皿[18,19]，薄的比色皿给装样带来了很大的不便，同时，树指相中的水分不容易去掉，需要在比色皿底部打一微孔，以便水分漏出。

总之，运用透射法测量，操作过程不易掌握，并且导致重现性差，一般需运用双波长等吸收点法来扣除背景误差,有人[20]对固相测量方式进行了改进，提出用反射法测量，并对固相反射光度法进行了理论的探讨，得出结论：

在局部浓度范围内，反射吸值AR与待测物浓度C有线性关系，为固相反射光度法进行定量分析奠定了基础，并成功地测定了矿样中的铁。

宋雅茹等[21]运用固相反射光度法测定了水中痕量磷，并对透射法和反射法进行了比较，认为两者具有相同的灵敏度，不同的是：

透射法比较费时，但对仪器要求不高；

而反射法比较省时，却需要具有积分球装置的紫外分光光度仪。

为了克服反射法所需仪器复杂的局限性，赵中一等[22]设计了一种简单的反射散射附件与国产的722型、721型分光光度计联用，以中速定量滤纸为载体，富集溶液中Ag（Ⅰ）—对二甲胺基苄叉若丹宁络合物，用固相反射光度法测定了地质试样中银的含量，结果满意。

反射法的引入突破了透射法要求固相吸附剂透光的限制，扩大了固相吸附剂的选择范围，从而也拓宽了固相光度法的应用范围。

固相光度法作为一种新痕量分析手段正在兴起，不断研究出新的固相载体，与其他技术联用更是增强了它的活力，拓宽了它的应用范围。

虽然还有很多的理论问题有待研究，许多实际应用领域有待开发，但在痕量分析中其发展前景是广阔的。

在分析化学中，固相光度法将会被更多的分析工作者熟悉、研究和应用。

1.3.3导数光度法

20世纪50年代初，导数技术开始引入紫外-可见和红外分光光度分析中，为分光光度法的发展开辟了一条新的途径。

此后，人们开展了对导数分光光度法的理论、实验技术和测量装置的研究。

20世纪70年代以来，随着低噪音运算放大器的出现和微型计算机在分光光度仪中的应用，简化了获得导数光谱方法，有力地推动了导数光谱的理论和应用研究的发展。

在分光光度分析中引入导数技术，扩展了分光光度法的应用范围，在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰和加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，导数分光光度法在一定程序上解决了普通分光光度法难于解决的问题。

1.3.4流动注射光度法

20世纪70年代中期由丹麦科学家J.Ruzicka教授和E.H.Hansen博士，美国的A.Stewart分别在连续流动分析和高效液相色谱的基础上提出的流动注射分析（Flowinjectionanalysis，简称FIA），近年来得到迅速发展，成为一门新型的微量溶液高速自动化分析技术。

FIA技术还能够与多种检测技术联用，如分光光度法、原子吸收法、荧光光度法、化学发光法和色谱法等，其中分光光度法的应用最多，这种结合给检测技术增添了新的活力。

流动注射光度法是FIA技术与分光光度法检测技术结合而发展起来的一种新方法，在这种方法中，FIA技术主要作为样品前处理及各种化学操作手段，用分光光度法作为检测手段，检测部分由分光光度仪和流通池组成[23]。

它具有试剂消耗量小和容易实现分析过程自动化等优点，在现代分析中占有很重要的地位。

目前，流动注射光度分析对象已从测定无机离子扩大到有机及生化分析领域。

第二章分光光度法测定与其他方法联用

2.1显微分光光度法

显微分光光度法是以光学显微放大技术和光度测量相结合对样品微区中的物质进行定量分析的一种方法，其测量装置是显微分光光度计。

该方法广泛用于生物学和医学领域[12]。

（1）测量方法

经聚焦的（直径为0.5至几十微米）探针型单色光束照射待测物上时，物质进行选择性吸收。

在生物医学领域中，由于样品的结构和形状比较复杂，切不均匀，容易引起测量光束漫反射、折射和衍射，使测量结果误差比较大，为了减小这种误差，在显微分光光度中，对单个细胞中化学物质的相对含量或绝地含量的的量一般采用以下三种方法。

（i）一波长双区域法

（ii）双波长法

（iii）扫描法

（2）显微分光光度计

显微分光光度计由光源、分光系统、显微系统、图象聚焦系统、机械扫描系统和镜扫描系统以及电子控制系统等六部分组成。

（i）光源

显微分光光度计中的光源通常采用高功率卤钨灯（100W）或氙灯（150W），前者使用于可见光谱区，后者使用于紫外-可见光谱区（180-1000nm），光源必须备有高稳定度的电源稳压装置。

（ii）分光系统

平面光栅作色散元件的单光束光学系统

（iii）显微系统

由分光器射出的单色光经扬光阑和聚光物镜，通过改变扬光阑可控制照明场大小，待测样品的区域和大小则由测量光阑控制。

观察系统则由物镜和目镜控制。

物镜对物品第一次进行放大，再经由目镜第二次放大后进行观察，或由摄影器用胶片记录。

经由物镜放大的象同时由分光配器反射到投影镜，将放大后的象投影到光电倍增管的阴极上，进行光电转换和接收。

投影镜的倍率可根据待测物的大小调节。

图象旋转系统设置在投影镜和测量光阑之间，由同步电机带动使图象作180。

转动，只是在染色体的图象旋转与测量光阑重合时，才可进行正常分析

（iv）图象聚焦系统

通常有两种聚焦系统，一种是用步进马达使齿轮与显微系统的细聚焦旋扭连接，通过观察物体在近焦区域时显示较黑暗的模糊区域，再由计算机检查，当地到两个面积最大值之间存在一个最小值为最佳聚焦。

另一种是Focovit自动聚焦系统，采用震动棱镜光栅，将显微镜视场下的放大图象投射在两个光度检测器上，获得两个相位的电信号以使电机驱动聚焦旋扭，得到最小的相位差，从而获得最佳焦距；

这两种聚焦，每聚焦一次需0.1s，聚焦精度为0.1um。

（v）机械扫描和镜扫描系统

机械扫描是指对样品作直接光点扫描，在X，Y两个方向上均用步进马达驱动，可改变扫描速度和扫描步距；

镜扫描是指样品经光学透镜放大后作影象扫描，由反射镜，作两个垂直方向的旋转运动，使放大图象相对测量光阑，作相对扫描运动，从而获得样品的吸收信息；

带有TV扫描的显微分光光度计可以获得物质的空间分布、微观精细结构，并可以进行细胞图象识别和分类[24]。

（vi）电子控制系统

仪器的光学和电学部件，均可用计算机控制，操作者通过键盘的控制整个显微分光光度计进行工作。

目前应用比较广泛的显微分光光度计有德国的LifeMPV-2型、OptonSMP-5型和我国的XFG-01型。

（3）显微分光光度法的应用

显微分光光度法是显微测定分析的有效手段。

该方法可用于测定单个细胞或者细胞微区中微量化学物质的相对含量和绝对含量，如细胞中的DNA、RNA、蛋白质、氨基酸、血红素、酶、多糖类、脂类、天然色素的测定，它是细胞学、组织化学、药物学、细胞病理学和免疫科学的研究的有效手段。

2.2反射光谱法

（1）基本原理

物质受光照射时，通常会发生两种不同的反射现象，即镜面反射和漫反射。

镜面反射如同镜子反射一样，光线不被物质吸收，反射角等于入射角，慢反射则必须满足库贝尔卡-芒克方程式：

（1–R∞）2/2R∞=K/S

式中K为吸收系数，与吸收光谱中的吸收吸收意义相同，S为散射系数，R∞表示无限厚样品的反射系数R的极限值。

实际上，反射系数（R∞≈1）标准物质比较来测定，测定R∞（样品）/R∞（标准物）比值，将此比值对波长作图，构成一定波长范围内该物质的反射光谱。

（2）测量装置

目前，大多数手动或自动记录式分光光度计都具备有反射附件，测量的波长范围由分光光度计的工作光谱区决定，可以是紫外区、可见区或是近红外区。

反射测量一般都采用与标准物比较的相对测量法。

因此，附件必须提供同时或连续照明标准物和样品的光学系统，通常的标准物有MgO，MgCO3等，这些物质都具有很高的反射系数。

在通常情况下，镜反射和漫反射一般同时发生，因而测量系统中必须设置消除镜反射的装置，常用黑体吸收法或选择垂直于样品表面的入射光束照射样品，而只检测轴外的漫反射，或者相反，以一定的入射角照射样品，而检测垂直于样品表面的反射组分。

（3）反射光谱法的应用

反射测量法只要用于食品（面包、不透明果汁）、涂料（油漆等）和建筑材料的分析，有些情况下也可以作定性和定量的测量，该方法最适合于作固体、不溶