吉大农学部09生计植物转基因及其安全性题库.docx
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吉大农学部09生计植物转基因及其安全性题库
《植物转基因及其安全性》试题库
一、名词解释
1、PCR：
多聚酶链式反应，用于体外扩增DNA片段。
2、分子克隆工具酶：
基因工程技术中能用于DNA和RNA的合成、切割、连接和修饰的各种酶。
3、基因沉默：
基因沉默是指转基因植物和转基因动物中，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。
4、限制性核酸内切酶：
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH基团和5’-磷酸基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。
5、受体细胞：
受体细胞也叫宿主细胞。
受体细胞有原核受体细胞（最主要是大肠杆菌）、真核受体细胞（最主要是酵母菌）、动物细胞和昆虫细胞（其实也是真核受体细胞）。
6、穿梭质粒载体：
是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
7、脉冲电场电泳法：
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。
DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。
8、报告基因：
指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。
9、探针：
在分子杂交中用来检测互补序列的带有标记的单链DNA或RNA片段。
10、转基因生物：
用基因工程技术导入外源基因的动植物，且外源基因能通过繁殖而传代。
11、选择标记基因：
是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。
12、核酸分子杂交：
把同源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程
13、同裂酶：
来源不同，但是具有相同的识别序列，如;BamHⅠ和BstⅠ
14、同尾酶：
不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端
15、星号反应：
酶的识别效率降低的现象。
16、质粒：
独立于细菌染色体外、具有自主复制能力的共价双链闭合环状DNA分子。
17、克隆载体：
使目的片段能在细菌细胞中复制的载体
18、表达载体：
使目的基因能在细菌细胞表达为RNA或蛋白质的载体
19、cosmid克隆载体：
人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体
20、荧光定量PCR：
是一种通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量的PCR技术。
22、转基因技术：
转基因技术是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技术。
创造出人类所需要的新品种或新物种。
23、转基因食品：
以转基因生物为食品或为原料加工生产的食品
24、DNA变性：
在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。
25、DNA复性：
当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。
26、退火：
指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。
27、质粒不亲和性：
在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。
28、转化：
指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。
二、简答题
1、何谓基因沉默，它的作用机制有哪些？
定义：
基因沉默（genesilencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象
作用机制：
基因沉默可以分为不同水平上的作用：
转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。
a.转录水平的基因沉默是DNA水平上基因调控的结果，主要是由启动子甲基化或导入基因异染色质化和位置效应所造成的.siRNA可使与其序列同源的基因组位点甲基化。
这种甲基化是由siRNA介导的转甲基酶作用的结果，如果甲基化发生在编码区，基因转录不受明显影响，但发生PTGS;若甲基化发生在启动子序列，则抑制了基因转录，出现转录水平基因沉默（TGS）。
此外，siRNA还能诱导DNA序列同源区的组蛋白发生甲基化等修饰或者改变染色体结构而抑制基因表达。
b.转录后水平的基因沉默是RNA水平基因调控的结果，这一过程分为启始和效应两个
阶段。
在启始阶段，较长的dsRNA（外源的或体内产生的）被Dieer切割成21一23nt的短双链siRNA;在效应阶段，siRNA与相关蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合体前体;在解旋酶作用下，由ATP供能将siRNA双链解开，RISC前体被激活;正义RNA单链被释放而反义RNA单链则介导该活化复合物识别并结合至靶mRNA，在不需ATP参与下切割靶mRNA，核酸外切醉将切割片断彻底降解，使之失去转录信息，从而特异性地抑制基因表达。
2、设计PCR的引物应遵守哪些原则？
①引物长度：
15-30bp，常用为20左右。
引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：
以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：
G+C含量以40-60%为宜。
G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带；ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列
④避免引物内部出现二级结构。
避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带
⑤引物3’端的碱基要求严格配对。
特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点。
被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处
⑦引物的特异性：
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
⑧引物量适宜：
每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好
引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会
3、用哪些方法可以检测转基因植物中的外源基因？
●报告基因的表达检测
●转基因植物的PCR检测
●外源基因整合的Southern杂交鉴定
●外源基因转录的Northern杂交检测
●外源基因表达蛋白的检测
●生物学鉴定
4、试述作为克隆载体的DNA分子必须具备的条件。
答：
（1）具有复制起点
（2）具有抗菌素抗性基因
（3）具有若干限制酶单一识别位点
（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。
5、细菌质粒的一般生物学特性?
1）很多细菌中已发现；
2）是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异；
3）大多数质粒的宿主范围较窄；
4）已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。
5）复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；
6）常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。
6、什么是限制性内切核酸酶的星号活性?
受哪些因素影响?
星号活性：
在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的现象。
影响因素：
1、甘油浓度过高;2、离子强度不合适;3、阳离子变化;4、pH变化;5、有机溶剂残留
7、切口移位（nicktranslation）标记探针的主要步骤有哪些?
1）、将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNA聚合酶I的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相结合。
2）、首先用DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，以互补的DNA单链为模板，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口的3末端-OH上。
3）、这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针
8、植物基因转化系统的选择原则?
（1）对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。
（2）原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。
（3）多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提高转化率。
（4）子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物，宜试用显微注射法，因为将外源DNA直接注入卵细胞的可能性较大。
（5）转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困难的植物，应采用基因枪法。
（6）根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。
9、限制性内切酶的识别特点
1）、大多数识别序列是很严格的，只有少数有变动的余地
2）、识别序列的碱基数一般为4—6个碱基对
3）、大多数识别位点具有180度旋转对称性，即回文结构（Palindromic）。
10、影响限制性核酸内切酶反应效率的因素
•1.温度：
一般37C，有例外,如：
BamHⅠ30C，
SmaI25C，TaqⅠ65C；
2.缓冲液：
高、中、低盐之分（NaCl），pH值；
•3.时间：
1-1.5小时
•4.反应体积和甘油浓度：
酶<1/10体积
•5.DNA纯度与构型
（1）纯度：
RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA，
EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA
（2）构型：
切超螺旋需更多的酶
例:
lgDNA,用EcoRI切,1U
超螺旋pUCl9,EcoRI2.5U
11、Klenow酶的基本性质及用途。
（1）基本性质：
•大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。
•Klenow酶仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。
（2）Klenow酶的基本用途：
•补平由核酸内切酶产生的3′粘性凹出末端；
•抹平DNA的3′粘性凸出末端；
•DNA片段的同位素末端标记；
•cDNA第二链的合成；
•双脱氧末端终止法测定DNA序列。
12、T4DNA连接酶作用机制。
T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：
①辅助因子ATP中磷酸基团与T4DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物；
②酶-AMP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸-磷酸酯键；
③DNA链3’羰的羟基活化与5’端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DNA链间的连接。
13、柯斯质粒载体的特点以及柯斯克隆的理论依据。
特点:
1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；
2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；
3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达45kb左右）；
4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。
广泛应用于基因组DNA文库的构建。
理论依据：
1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点）。
2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。
在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。
3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系,又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点（38-45kb），将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。
14、核酸凝胶电泳的基本原理
1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；
2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。
而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；
因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。
15、DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率决定因素
① DNA 的分子大小，分子越大，则摩擦阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢；
②琼脂糖浓度，一个给定大小的线状 DNA 片断，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同；
③ DNA 分子的构象：
超螺旋的迁移率大于线性的大于单链开环的DNA。
④电源电压，在低电压下，线状 DNA 片断的迁移速率与所加电压成正比。
但是，随着分子量的增加，高分子量 DNA 片断的迁移率将以不同的幅度增长。
因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小；
⑤电场方向；⑥碱基组成和温度；⑦嵌入染料的存在；⑧电泳缓冲液的组成。
16、凝胶载样缓冲液的组成及其作用。
缓冲液的组成：
EDTA、甘油、二甲苯青FF、溴酚蓝
载样缓冲液有三个作用：
1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；
2）使样品带有颜色便于简化上样过程；
3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。
17、表达载体的必备条件。
（1）能自主复制
（2）具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记
（3）具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的强大启动子
（4）启动子应可受诱导调控
（5）具有强终止子
（6）具有翻译起始信号
18、什么是转基因食品的实质等同性原则，转基因食品安全检验的五项原则是什么？
答：
实质等同性原则即如果某个新食品或食品成分与现有的食品或食品成分大体等同，那
么它们是同等安全的。
五项原则：
1）如两者本质是相同的，用传统的安全性评价程序对转基因食品评价。
2）如在一定范围内有差别，用集中于对产生差别的因子进行评价。
3）如果氨基酸序列与已知蛋白毒素的氨基酸序列是同系物，则要进行毒理学实验。
4）如有蛋白质产生了抗营养作用，或营养成分发生改变，则要进行营养学评价。
5）如两者完全不同或没可比的传统食品，则要特别设计动物模型试验证明其无毒后，须进行人体营养学试验。
19、标记基因是什么，它有什么用处？
标记基因涉及的安全性问题有哪些？
定义：
简称选择基因，是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。
用处：
作为筛选标记，筛选出转基因是否成功。
安全性问题：
1.标记基因滞留在植物体内并持久表达不仅给植物生长发育增加负担，而且给其它有利性状基因的表达带来不确定的影响。
2.对于环境释放或商品化生产的转基因植物而言，人们担心标记基因的抗性迁移会给目前使用的除草剂和抗生素带来挑战。
3.目前可供利用的标记基因数量是有限的，这给在植物中再次导入外源基因带来限制。
20、标记基因安全性评价的内容？
1 标记基因有无直接毒性：
任何DNA都由4种碱基组合而成,目前所用的标记基因
在DNA组成上并无异常。
转基因食品中外源基因的含量很少，与消化道中持续存在的其他DNA相比是微不足道。
。
根据所有生物食品都含有大量DNA,DNA在肠胃道中很快被降解,标记基因的DNA组成并无异常,WHO及FDA）得出结论认为食物中的转基因DNA本身并无安全性问题。
2 基因水平转移的可能性：
人们食用转基因植物食品后，其中的绝大部分DNA已降解,并在肠胃道中失活。
极小部分（<0.1%）是否会有安全性问题?
例如标记基因特别是抗生素标记基因会否水平转移至肠道微生物或上皮细胞,从而降低抗生素在临床治疗中的有效性?
目前的结论是:
这种可能性非常小,除非在特例中需加考虑。
理由是:
1）DNA从植物细胞中释放出来后,很快被降解成小片段,甚至核苷酸,因此植物DNA在进入有肠道微生物存在的小肠下段、盲肠及结肠前已被降解。
2）即使DNA完整地存在,DNA转移并整合进受体细胞也是一个非常复杂的过程,包
括许多步骤:
（1）DNA必须与细胞结合,穿过细胞膜进入细胞,且不被宿主细胞内的核酸酶及修饰系统降解。
（2）受体细胞必须呈感受态。
（3）为与受体细胞的基因组发生重组,供体和受体至少要有一段20bp的DNA完全同源。
（4）要有合适的调控系统才能表达。
（5）标记基因的表达只有在筛选压下才有优势,对抗生素标记而言,只有在口服抗生素后才有这种选择压。
（6）目前尚不知在消化系统中有植物DNA转至微生物的机制,上皮细胞又因新陈代谢、半衰期很短而被不断取代,不可能保存下来。
因此标记基因水平转移并表达的可能性极小，工程植物原材料及未煮过种子中的标记基因DNA不可能产生安全性问题,经食品加工后的植物材料则更不可能。
3 未预料的基因多效性 基因的多效性有的可预测,有的则不可预测,其效应可有利或不利。
多效性包括次生效应,如插入位点及插入基因产物所引发的“下游”效应,影响代谢过程。
如新霉素磷酸转移酶标记基因可改变细胞的磷酸化状态。
21、基因工程诞生的理论基础是什么？
现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论上的三大发现：
①证实了DNA是遗传物质
②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理
③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定
技术上的三大发明：
①限制核酸内切酶的发现与DNA切割
②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接
③基因工程载体的研究与应用
22、蓝-白筛选的原理？
答：
某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。
这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。
如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。
由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。
23、PCR的基本原理？
答：
PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。
PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。
需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。
DNA模板变性：
模板双链DNA?
单链DNA，94℃。
退火：
引物＋单链DNA?
杂交链，引物的Tm值。
引物的延伸：
温度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。
新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。
三、论述题
1、目前常用的转基因方法有哪些，各有何特点？
外源基因的间接转化法（载体介导法）
（1）农杆菌介导法：
它是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。
利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。
（2）病毒介导法：
病毒载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。
但是病毒载体的容量有限,不能包装大片段的外源DNA基因组,寄主范围窄,复制稳定性差,转录和复制机理复杂。
用的较多的是花椰菜花斑病病毒（CaMV）和番茄金花叶病毒（TGMV）。
此法需要注意的是其他病毒侵染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换,进而导致载体病毒重新获得其致病能力”因此,其潜在的危害性必须予以足够的重视。
外源基因的直接转化法
（1）化学诱导DNA直接转化：
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前主要有2种方法：
PEG介导法和脂质体介导法。
（2）物理法诱导DNA直接转化：
物理转化方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞。
它不仅能够以原生质体为受体，还可以直接以植物细胞乃至组织、器官作为靶受体，因此比化学法更具有广泛性和使用性。
常用的物理方法有电激法、超声波法、显微注射法和基因枪法。
（3）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）：
花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。
这一技术可以应用于任何开花植物。
2、植物转基因受体材料有哪些？
试述选择受体细胞的原则。
答：
受体材料有：
原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、胚状体、叶片切块
其它受体：
如花、子房、离体条件下的子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花粉等
原则：
1）、高效稳定的再生能力；
2）、受体材料要有较高的遗传稳定性；
3）、外植体来源方便，如胚和其它器官等；
4）、对筛选剂敏感；
5）、转化率高
3、说明SangerDNA测序法与Maxam-Gilbert的化学降解测序法原理与方法的异同点。
（一）Maxam-Gilbert的化学降解测序法
基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。
测序步骤：
•1、先用限制性内切酶把DNA切成100—200bp的测序材料；
•2、取待测DNA的一股链，使其一端（一般为5’端）用32P标记。
•3、样品分成4分，分别在选定条件下与专一性试剂作用（4组特异的反应）。
每一份样品各生成一套长短不等的放射性片段。
•4、应用凝胶电泳分离每一反应的产物，放射自显影后，根据按长短排列、具特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。
（二）Sanger的酶聚合测序法（链终止法）
基本原理如下：
①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。
常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活
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