微生物学实验指导Word格式文档下载.docx

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若配制试管斜面固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。

若是在平皿中制成平板固体培养基，则将称好的琼脂放入三角瓶中，放入高压灭菌锅灭菌，灭好菌后再倒入平皿。

3．调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/LNaOH，边加边搅拌，并随

时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。

若偏碱，则用lmol/LHCl进行调节。

pH的调节通常放在加琼脂之前。

应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。

但是供一般使用的培养基，这步可省略。

5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入三角瓶内。

做试管斜面分装入试管时，将已煮好的培养基趁热分装于试管中，分装装置可用带铁环和漏斗的分装架，分装时，试管垂直桌面，注意不要使培养基残留在试管口附近，以免污染。

一般培养基装量为试管长度的1/5～1/4，塞上乳胶塞。

分装量：

固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。

分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

6．加试管塞试管口和三角瓶口塞上试管塞。

7．包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿试管塞。

若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。

然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。

8．灭菌将上述培养基于121.0℃湿热灭菌20min。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9．摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使之自然冷却，凝固成斜面，斜面的长度约为试管长的1/2，斜面摆好后，在培养基凝固以前，不宜再移动。

10．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24h～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（二）高氏l号培养基的配制

高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。

可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·

3H2O0.5g，MgSO4·

7H2O0.5g，

FeSO4·

7H2O0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。

l．称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。

再加入其他成分依次溶解。

对微量成分FeSO4·

7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4·

7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL

培养基中加入以上贮备液1mL即可。

待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2．pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

（三）PDA培养基的配制

PDA培养基是用于培养真菌常用的培养基，其配方如下：

马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然。

1．配制：

将去皮的马铃薯切成小块，加水1000毫升，煮沸15－20分钟，用四层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂用文火使其溶化（若使用琼脂条可先剪成小段，煮琼脂时要多搅拌，直至完全溶化），最后补足水分至1000mL。

搅拌均匀。

倒平板的方法：

右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；

然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

五、注意事项

称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。

调pH时要小心操作，避免回调。

不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

六、实验报告

记录本实验配制培养基的名称、数量，指明要点。

本组做了高氏1号培养基30个

要点：

溶解药品时，一定要变加热边溶解；

还有，溶解淀粉时，用少量水溶解，然后在加大量水。

七、问题和思考

l．配制培养基有哪几个步骤?

培养基中加琼脂的作用是什么？

琼脂融化要注意什么？

配置培养基的步骤：

计算→称量→溶化→调节pH→分装→加棉塞→包扎→灭菌→搁置斜面

加琼脂的作用：

充当固化剂，起支持作用。

琼脂融化注意：

温度不能太高也不能太低；

受热均匀；

加热完后，在合适的温度倒平板，防止凝固。

2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?

若不能及时灭菌应如何处理?

已灭菌的培养基如何进行无菌检查?

很明显，培养基里含有丰富的氮源，碳源，微量元素等等。

如果不立即灭菌，那么，就会长菌。

你可能会认为再灭菌不就可以了？

！

但是，很多的微生物，特别是真核微生物在生长的时候会改变溶液的PH，同时灭菌后细胞破碎，带入新的氨基酸，蛋白等，这些都是试验不稳定的因素。

如果不能立刻灭菌，应该在配置培养基的时候直接称取粉末，不加入水溶解，可在室温保存。

如果加入的是液体的，已经配置好的培养基，应该在4度并保存，但时间不宜过长。

已经灭菌的培养基灭菌时残留有生命力的孢子或在贮存时有可能被杂菌污染，所以在使用该培养基时要进行无菌检查通常是放在37℃的恒温箱中一两天后培养基上没有生长任何微生物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的肉眼可以看见的）

土壤中微生物的分离、纯化

——微生物的纯培养

了解微生物分离和纯化的原理；

掌握常用的分离纯化微生物的方法。

二、实验原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

三、实验器材

3.1培养基

淀粉琼脂培养基（高氏I号培养基），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，PDA培养基。

3.2溶液或试剂

盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。

3.3仪器或其它用具

无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，土样，显微镜。

四、实验步骤

4.1稀释涂布平板法

1．取土壤取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。

2．制备稀释液（要无菌操作）

（1）制备土壤悬液：

称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底力最好），振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

（2）稀释：

用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液。

注意：

操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

3.混菌法测定菌落数的方法

（1）细菌：

取10-7、10-6、10-5三管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。

然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。

倒平板时要注意无菌操作。

（2）放线菌：

分别取10-5、10-4、10-3三管稀释液1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。

（3）霉菌：

取10-2、10-3、10-4两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。

选用融化的PDA培养基中，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。

4．培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，霉菌培养3～5d。

观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。

4.2平板划线分离法

1.倒平板

按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和划线。

在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线（图4-3）。

划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。

划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

2.挑菌落

同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止

4.3继续划线分离获得纯培养

将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞，采用划线的方法接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，进行分离、纯化，获得纯培养。

现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

（1）倒平板按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和划线。

（2）挑菌落

同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

五、思考题：

1.所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？

如果不是，请分析其原因并重做。

所做涂布平板法和划线法没有较好地得到了单菌落。

原因：

接种环未冷却，导致细菌烫死；

涂布的时候没涂开；

接种环未彻底灭菌。

2.在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？

简述它们的菌落特征。

细菌：

比较小，表面或光滑粘稠，或粗糙干燥，易挑起

放线菌：

干燥，多皱，难挑起，菌落较小，多有色素

霉菌：

菌丝细长，菌落疏松，常呈绒毛状，有时还呈红黄黑等颜色

革兰氏染色法及显微镜使用

一、实验目的：

学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。

二、实验原理：

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。

因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

1、活材料：

培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillussubtilis）；

培养24小时的大肠杆菌（Escherichiacoli）；

前次实验从土壤中分离的细菌培养物。

2、染色液和试剂：

2.1结晶紫溶液：

结晶紫乙醇饱和溶液（取结晶紫约4～8g，溶于95%乙醇100ml中）20ml，1%草酸铵溶液80ml，将上述两溶液混合，过滤。

静置48h后使用。

结晶紫不可用龙胆紫代替。

前者是纯品，后者不是单一成分，易出假阳性。

结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。

2.2卢哥氏碘液（Lugol）

碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL

先将KI溶解在少许水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，充分振荡，待碘完全溶解后再加入其余的蒸馏水，定容。

当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。

为易于储备，可将上列碘与碘化钾溶于30ml蒸馏水中，配成10倍母液，使用用前稀释使用。

2.3脱色剂95%乙醇

2.4番红复染剂

番红2.5g，95%乙醇100mL

取上述配好的番红酒精溶液10mL与80mL蒸馏水混匀即可使用。

四、实验方法

1涂片用镊子取出载玻片，在取两块载玻片各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，分别用接种环挑取菌液涂布于生理盐水中，涂匀形成薄膜。

（注意：

接种环挑菌前后均应于酒精灯火焰上灼烧）。

2干燥室温中自然干燥。

3固定：

涂片面向上，于火焰上通过2-3次，以固定细胞形态。

注意不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

4初染加1滴结晶紫染料，染色约1分钟，水洗至冲下之水无色为止。

注意水流不应过急，过大，水由薄片上端流下，避免直接冲在涂片处。

5媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖1分钟左右，水洗。

6脱色将载玻片上的水甩净，衬以白背景，用95%的酒精洗至酒精刚刚不出现紫色时为止，大约20-30秒，立即用水冲净酒精。

7负染用番红液染2-3分钟，水洗。

晾干或用吸水纸吸干。

8镜检显微镜观察载玻片置于显微镜下观察。

镜检。

呈紫色者为革兰氏阳性菌，红色者为阴性菌。

如用油镜观察的话，滴上一滴香柏油，将油镜浸在香柏油中观察。

实验完毕后，显微镜上镜头及载玻片上的香柏油用擦镜纸粘上二甲苯擦干净。

9同样的方法挑取土壤中分离的菌落制片观察革兰氏反应。

注：

革兰氏染色成功的关键在于严格掌握酒精脱色程度，脱色过度，阳性菌可被误染为阴性菌。

脱色不够，阴性菌可误染为阳性菌。

菌龄也影响染色结果，阳性菌培养时间过长，也常呈阴性反应。

显微镜油浸系物镜的使用

一、实验目的和内容

目的：

复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。

内容：

1．学习油浸系物镜的使用方法。

2．用油镜观察革兰氏染色装片。

二、实验材料和用具

枯草芽孢杆菌（Bacillussubitilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的染色装片。

香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。

三、操作步骤

（一）观察前的准备

1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。

坐正，练习用左眼观

察。

2．调节光源：

将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。

转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。

观察染色装片时，光线宜强；

观察末染色装片时，光线不宜太强。

（二）低倍镜观察染色装片

首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。

移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。

（三）高倍镜观察

眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。

再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。

用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。

将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。

不要移动装片位置，准备用油镜观察。

（四）油镜观察

1.油镜头的辨认油镜头上常刻有OI（oilimmersion）或HI（homogeneneousimmersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numericalaperture）最大，而工作距离最短。

2．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。

在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。

3．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。

4．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反方向旋转），当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。

如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。

仔细观察并绘图。

5．再次观察提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。

重复观察时可比第一次少加香柏油。

（五）镜检完毕后的工作

1．移开物镜镜头。

2．取出装片。

3．清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。

4．擦净显微镜，将各部分还原。

将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。

最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。

四、注意事项

1．使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察

2．下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。

3．使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。

4．注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。

五、实验报告

分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。