番茄ISSRPCR反应体系优化与验证Word文档下载推荐.docx

番茄ISSRPCR反应体系优化与验证Word文档下载推荐.docx

《番茄ISSRPCR反应体系优化与验证Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《番茄ISSRPCR反应体系优化与验证Word文档下载推荐.docx（6页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

优化中图分类号：

S795.9文献标志码：

A论文编号：

cjas15080012基金项目：

福建省自然科学基金项目“利用SSR和SRAP标记构建辣椒遗传图谱”（2014J01115）；

福建省农业科技重大专项“茄果类蔬菜新品种选育与种业产业化研究”（2013NZ0002-3）。

第一作者简介：

李永平，女，1974年出生，福建顺昌人，硕士，研究方向：

蔬菜育种。

通信地址：

350003福建省福州市五四路247号福建省农科院高新大楼1711，E-mail：

[emailprotected]。

通讯作者：

康建坂，男，1976年出生，福建永春人，副研究员，硕士，研究方向：

收稿日期：

2015-08-20，修回日期：

2015-11-16。

0引言在生物技术研究领域中，分子技术一直是研究的热点。

ISSR结合了SSR和RAPD的优点，克服了RFLP与RAPD的不足，简单方便，可以检测到更高的种间遗传差异，稳定性也较高[1-3]。

因此，ISSR标记技术被广泛应用于遗传多样性[4-6]、遗传图谱构建[7-8]、种子纯度鉴定[9-10]、植物分类学[11]等研究中，但ISSR-PCR的扩增效果受物种、反应体系及扩增程序等的影响，不同作物最佳反应体系差异较大。

番茄（Lycopersiconesculentum）因果实营养丰富，具特殊风味，是在全世界栽培最普遍的果菜之一，中国各地也普遍种植。

1994年，加拿大蒙特利大学Zietkiewicze等[12]利用了RAPD技术优点和基因组中丰富的SSR序列信息，提出了一种新的分子标记技术（inter-simplesequencerepeat，简单重复间序列，ISSR）。

它可用少量DNA在没有分子生物学研究基础的情况下构建基因组指纹图谱[13-15]，由于可同时检测多个SSR座位，重复性好，被广泛应用于遗传多样性[16-19]、种质资源鉴定[12]、分子辅助育种[20]、基因定位[21]、种子纯度鉴定[22-23]、植物分类学[24]等方面。

ISSR标记能补充遗传图谱中一些RFLP标记稀少、间断或空白区，它在QTL定位中也逐渐得到较多的应用[1-2]。

ISSR是基于PCR的分子标记技术，不同植物材料、实验材料及不同扩增条件都将影响其扩增效果[3-4]。

笔者对影响番茄ISSR-PCR反应体系主要因素进行优化实验，旨在建立番茄ISSR-PCR最佳反应体系，为ISSR技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。

1材料与方法1.1供试材料研究所用材料由福建省农业科学院蔬菜中心提供，体系建立材料为番茄高代自交系T9，验证材料为38个番茄高代自交系。

主要试剂为10×

PCRbuffer（含Mg+，Tiangen公司产），TaqDNA聚合酶（Tiangen公司），dNTP（上海生工生物工程公司产），Mark2000（上海生工生物工程公司产）。

ISSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2实验方法1.2.1基因组DNA的提取与检测各番茄品种选取3株健壮、无病虫害、具有本品种特征特性的植株混合取样，每株摘取1~2片幼小、舒展的心叶，用改进的微量CTAB法[5-8]提取DNA。

加入1μLRNase，37℃水浴30min，纯化DNA。

检测各样品的纯度并计算其浓度，将各样品浓度稀释至50ng/μL备用。

用8g/L琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性。

1.2.2ISSR-PCR扩增及产物的电泳分析扩增反应在GeneAmpPCRSystem9600（Applera公司）上进行。

实验采用20μL体系：

2.0mmol/LMgCl2，2.0μL10×

PCR缓冲液，50ng模板DNA，0.3μmol/L引物，0.50mmol/LdNTP，2.0UTaqDNA聚合酶，加入超纯水至20μL。

PCR扩增程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性1min，52.2℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；

72℃延伸5min，4℃保存。

PCR扩增产物用15g/L的琼脂糖凝胶在120V稳压电泳50min，EB染色15min，在GDS8000凝胶成像系统（UVP公司）上观察并拍照。

1.2.3ISSR-PCR扩增反应因素筛选及程序调整以番茄高代自交系T9DNA为模板，ISSR引物823，对ISSR扩增反应其中一成分设置梯度进行筛选时，保持其他成分的浓度不变，用双蒸水调节保持总体积不变；

扩增程序中的退火温度设计12个温度梯度49.0、50.0、51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃。

2结果与分析2.1DNA模板浓度对番茄ISSR-PCR的影响DNA模板是影响PCR扩增重要因素，对模板DNA浓度进行优化非常必要。

ISSR-PCR反应中，DNA浓度太低可能无扩增产物，浓度过高则出现非特异性扩增条带甚至会抑制扩增。

反应结果见图1，模板使用量在30~100ng范围内5个不同量的DNA模板均有扩增产物，DNA量在少于50ng时，随着DNA量增加条带逐渐清晰，随后DNA量增加条带清晰度下降，当DNA量增加到100ng时条带就有缺失，50ng时条带最为清晰。

2.2引物用量对番茄ISSR-PCR的影响引物浓度影响引物与DNA模板配对概率，从而影响ISSR-PCR扩增效率。

引物浓度低，与DNA模板结合位点就少，扩增产量就低；

浓度过高，产生非特异性扩增，带型弥散模糊。

引物用量对番茄ISSR扩增的影响结果见图2。

用量为0.1、0.2、0.4、0.5μmol/L时扩增条带比较模糊，用量0.3μmol/L时条带最清晰，因此，最终选用0.3μmol/L为最佳用量。

2.3dNTP浓度对番茄ISSR-PCR的影响dNTP作为PCR反应原料，浓度直接影响反应产量与特异性。

不同浓度的dNTP对番茄ISSR扩增产物的影响结果见图3。

可见实验体系使用的浓度为0.25~0.625mmol/L时随浓度升高，条带清晰度增加，浓度到0.75mmol/L时，条带模糊。

浓度为0.5、0.625mmol/L条带较为清晰，考虑材料的成本，选择dNTP浓度为0.5mmol/L。

2.4TaqDNA聚合酶浓度对番茄ISSR-PCR的影响PCR扩增效果直接受到TaqDNA聚合酶活性和用量影响。

用量过少，酶过早消耗完，产物就少；

用量过多，产生非特异扩增，带型弥散。

5个TaqDNA聚合酶浓度梯度的扩增结果见图4。

浓度为2、2.5U时条带完整清晰，3U时条带弥散模糊，综合考虑扩增效果与成本，选用TaqDNA聚合酶浓度为2U。

2.5退火温度的筛选退火温度对ISSR-PCR反应结果影响很大，实验设计的12个温度梯度49.0、50.0、51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃筛选引物的最佳退火温度（表1）。

实验结果表明，每条引物有其独特的退火温度，23条引物中退火温度最低的为49.0℃，最高的是55.0℃。

各引物的最佳退火温度与TM值之差大多在5℃之内，引物874的最佳退火温度与TM值之差达到9.7℃。

2.6体系的验证引物868对38个番茄高代自交系在50ng模板DNA，0.3μmol/L引物，0.50mmol/LdNTP，2.0UTaqDNA聚合酶，2.0mmol/LMgCl2，2.0μL10PCR缓冲液，加入灭菌的超纯水至20μL的体系，退火温度50.0℃进行ISSR-PCR扩增（图5），表明实验所建立的番茄ISSR-PCR的反应体系扩增效果良好。

2.7番茄ISSR-PCR的反应体系的确立通过实验确立的番茄ISSR-PCR的20μL反应体系为：

2.0μL10×

PCR缓冲液，50ng模板DNA，0.3μmol/L引物，0.50mmol/LdNTP，2.0UTaqDNA聚合酶，加入灭菌的超纯水至20μL。

扩增程序为94℃预变性5min；

94℃变性1min，50℃，退火1min，72℃延伸2min，35个循环；

72℃延伸5min。

各引物退火温度有所差异参照表1。

3讨论在生物技术研究领域中，分子技术一直是研究的热点。

ISSR结合了SSR和RAPD的优点，克服了RFLP与RAPD的不足，简单方便，可以检测到更高的种间遗传差异，稳定性也较高[9-11]。

但ISSR-PCR的扩增效果受物种、反应体系及扩增程序等的影响，不同作物最佳反应体系差异较大。

根据不同物种ISSR-PCR反应最佳体系报道[25-28]，引物用量多在0.1~0.8μmol/L，模板DNA在30~100ng，dNTP0.1~0.4mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5~1.5U。

本实验TaqDNA聚合酶用量较高,20μL反应体系中TaqDNA聚合酶浓度为2、2.5U时条带完整清晰,dNTP用量也较高，浓度为0.5、0.625mmol/L条带较为清晰，模板DNA、引物用量与大部分研究一致。

笔者研究表明，退火温度是影响实验结果的关键因素，且各引物的最佳退火温度差异较大，23个引物的最佳退火温度在49.0~55.0℃。

ISSR标记使用单引物，长度15~22bp，各引物TM值不同。

林郑和等[29]在建立茶树ISSR-PCR反应体系时发现，退火温度在大于引物TM值2~3.0℃。

何海旺等[30]研究马铃薯ISSRPCR反应体系则认为，不同引物对退火温度的反应规律不同，退火温度较TM值有高有低，但基本都在5℃以内。

笔者的结果与两者的研究均有不同，退火温度与TM值之差最大达到9℃以上。

这可能研究物种与引物序列有关。

参考文献[1]周元昌,陈启锋,吴为人,等.作物QTL定位研究进展[J].福建农业大学学报,2000,29

（2）:

138-144.[2]王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J].遗传,2002,24（5）:

613-616.[3]姚明,王新超,陈亮,等.茶树ISSR-PCR反应体系的建立[J].茶叶科学,2004,24（3）:

172-176.[4]朱为民,王曙霞,杨少军,等.番茄ISSR-PCR反应体系的优化[J].上海农业学报,2007,23（3）:

5-8.[5]江昌俊,陈彦.分离芸薹属植物基因组DNA的一种方法[J].中国油料,1995,17（4）:

34-36.[6]朱海生.樱桃番茄种质资源遗传多样性及杂交种纯度鉴定RAPD分析[D].福州:

福建农林大学,2005.[7]CullingsKW.Designandtestingofaplant-specificPCRprimerforecologicalandevolutionarystudies[J].MolecularEcology,1992,1（4）:

233-240.[8]Williamson.APCR-basedmarkertightlylinkedtothenematoderesistancegene,Miintomato[J].TheorApplGenet,1994,8:

757-763.[9]潘丽梅,朱建华,秦献泉,等.龙荔基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的建立与优化[J].西南农业学报,2009,22

（1）:

145-149.[10]高山,林碧英,许端祥,等.苦瓜种质遗传多样性的RAPD和ISSR分析[J].植物遗传资源学报,2010,l1

（1）:

78-83.[11]王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J].遗传,2002,24（5）:

613-616.[12]ZietkiewiczE,Rafalskia,LabudaD.Genomefingerprintingbysimplesequencerepeat（SSR）anchoredpolymerasechainreactionamplification[J].Genomics,1994,20:

176-183.[13]BornetB,BranchardM.Nonanchoredintersimplesequencerepeat（ISSR）markers:

reproducibleandspecifictoolsforgenomefingerprinting[J].PlantMolecularBiologyReporter,2002（19）:

209-210.[14]缪恒彬,陈发棣,赵宏波,等.应用ISSR对25个小菊品种进行遗传多样性分析及指纹图谱构建[J].中国农业科学,2008,41（11）:

3735-3740.[15]宣继萍,章镇,房经贵,等.苹果品种ISSR指纹图谱构建[J].果树学报,2002,19（6）:

421-423.[16]RatnaparkhemB,SanTradK,TulluA,etal.Inheritanceofintersimple-sequece-repeatpolymorphismsandlinkagewithafusariumwiltresistancegeneinchickpea[J].TheorApplGenet,1998,96:

348-353.[17]邓思珊,刘洪旭,孟春,等.福建三明不同地理种源草珊瑚亲缘关系ISSR分析[J].中国中医药信息杂志,2015,9（22）:

83-86.[18]刘娟,廖康,赵世荣,等.新疆野杏种质资源遗传多样性及亲缘关系的ISSR分析[J].新疆农业大学学报,2015,38

（2）:

105-113.[19]汪爱华,丁毅.西藏近缘野生大麦RAPD和ISSR分子标记的遗传多样性[J].武汉大学学报:

理学版,2007（6）:

723-730.[20]DoyleJJ,DoyleJL.ArapidDNAisolationprocedureforsmallquantitiesoffreshleaftissue[J].PhytochenBul,1987,19:

11-15.[21]KojimaT,NagaokaT,NokaK.GeneticlinkagemapofISSRandRAPDmarkersinEinkornwheatinrelationtoRFLPmarkers[J].TheorApplGennet,1998,96:

37-45.[22]杨中周.分子标记技术在辣椒种子纯度检测中的应用[J].中国瓜菜,2015,28（3）:

1-4.[23]陈龙正,徐海,宋波,等.利用ISSR分子标记鉴定苦瓜杂种纯度[J].AgricuturalScienceTechnology,2015,16（4）:

649-652.[24]刘磊,王宗礼,李志勇,等.基于ISSR分子标记的扁蓿豆植物分类学研究[J].中国草地学报,2015（3）:

26-30.[25]原晓龙,周军,陶磅,等.草莓ISSR-PCR体系的建立与优化[J].西南农业学报,2014,27（5）:

2106-2110.[26]何海燕,沙伟,张艳馥.大豆ISSR-PCR反应体系的优化[J].大豆科学,2010,29（3）:

510-513.[27]田艳伶,李志辉,杨模华,等.钩栗ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].中南林业科技大学学报,2015,35

（2）:

32-37.[28]尹光晶,宋廷宇,吴春艳,等.豇豆ISSR-PCR反应体系的建立[J].北方园艺,2012（12）:

141-143.[29]林郑和,陈荣冰,陈常颂.茶树ISSR-PCR反应体系研究[J].福建农业学报,2006（3）:

247-252.[30]何海旺,谭冠宁,何虎翼,等.早熟马铃薯ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选[J].广东农业科学2015

（1）:

133-137.