细胞生物学实验指导Word文件下载.docx

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一般显微镜是让光线通过标本后直接进入物镜成象。

但某些标本不易染色或常规方法不易看清，这时可试用暗视野显微镜，它与常规显微镜不同的是用强而窄的斜光束从侧面照射标本而不让光束直接进人物镜，这时视野是暗的，但在黑暗的背景上以看到标本中的微粒光点（这与在暗室中看到光束中的灰尘情况相以）．用这种显微镜可以观察血液，淋巴液、唾液，胶质，纤维及晶体等组织，但0.3um以下的微粒则不易判断其大小内部结构，在普通显微镜上改用一个暗视野聚光器附件使其可改装成暗视野显微镜。

（二）倒置显微镜：

一般生物显微镜的焦距很短，无法观察装在培养瓶底部的细胞等物质，为此，专门有一种倒置显微镜可用于这种观察，它的光线是从上往下照，物镜侧是置于被观察物镜的底部，向上观察，它的物镜焦距较长，可透过玻瓶壁观察沉聚的细胞等-倒置显微镜已成为细胞组织培养工作中一种重要的观察工具。

（三）摄影显微镜：

摄影显微镜是在普通显生物微镜的基础上增加一套光路，接驳一部摄影机，录观察到有价值的标本时，即可开动摄影机将景象保存下来．近年来又在此基础上制造了电视显微镜，可供多人同时观察，并将图象记录下来，电视显微镜实际上是将摄影显微镜中的摄影机换装上彩色摄象枪，所以摄得的图象可直接在彩色电视机或监视器上显示，供多人观察，有价值的图象还可以用录象机录下来保存，日后重放．更高档的电视显微镜还可以通过视频处理卡与电脑连接，将图象转存电脑存储器中，或通过彩色打印机即时打印出彩色图片，以上装置，都给教学及科研提供了很大方便。

但一般电视显微镜所记录图象光学质量要比普通摄影方法差些．这是其不足之处。

（四）荧光显微镜：

有些物质被紫外线照射后，会发出荧光，并显示不同的光量．即使不呈荧光现象的物质，可以用荧光素来处理，人为地使其产生荧光现象。

荧光显微镜的最大点是灵敏度很高，很低浓度的荧光物质便可使标本的对比度提高成百倍．并且荧光还能揭示物质的化学成份．荧光显微镜现已广泛用于微生物学、免疫学、组织化学以及微量，痕量物质分析等各个领域，用途很广泛。

荧光显微镜的基本结构也与普通生物显微镜相似，但它不使用自然光而用高压汞灯作光源，产生紫外线，激发出荧光，为了不使紫外线有较多衰减，其光学部件要采用镀铝反射镜，用石英或能通过紫外线的荧石制作聚光器，物镜；

用油镜观察时要用甘油等。

（五）偏振光显微镜：

我们在有机化学中知道，不少有机物质有自己持定的旋光性．偏光显微镜就是利用了这一原理，在其光路中增加了起偏器、检偏器等装置，加强了标本中各向同性和各向异性细节二者间的对比，能显出一般自然光下看不见的结构及变化过程，如神经组织被割断一个小时后，用偏差光显微镜已能看到它的变化过程，若用自然光，则需3天才能观察到，这时神经已经变性．偏差显微镜还可以显出在不同媒质中活细胞的内含物和结构细节，可以用来研究肌肉、神经，头发、脂肪，骨质等多种组织结构成份的分辨正常细胞和癌细胞（因它们有不同的旋光性），当在普通显微镜看不出其区别时，用偏光显微镜检查则可以发现它们呈强烈的颜色对比。

（六）相差显微镜：

对有些活细胞明暗对比很不明显的标本，如果不能用染色方法，则不易看清细节，相差显微镜主要用于观察不染色的新鲜标本，甚至能将活细胞中的高尔基氏器及线粒体显示出来．其工作原理是光线在不同媒质中传播速度不同，出现程差，当标本细节与背景的折射率与厚度不同时，它们透过的光线之间还会发生位相差．这时再将位相差通过某种光学部件，就可以转换成亮度差，就可以看清标本的细节了。

（七）其它：

如超声波显微镜，红外线微镜，紫外线显微镜等，由于一般科研和教学中使用不多，这里就不再多作介绍了。

实验二昆虫细胞培养实验操作规范

一、细胞培养室的环境

1.细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件：

1）培养室应为独立、封闭的空间。

培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入；

2）保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15~30min；

每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30min以上；

3）定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；

定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒；

4）每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。

5）定期清理冰箱。

将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除；

6）培养箱要定期清洁。

隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；

并要注意底层水箱的水位，及时补充水份；

7）注意监测CO2的气压，及时补充。

8）注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。

2.实验器具的清洗、消毒灭菌：

1）反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：

清水浸泡→去污剂刷洗→清水冲洗→超声波洗涤→洗液浸泡（过夜）→充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）→蒸馏水漂洗→烘干；

若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。

*洗液：

浓硫酸+重铬酸钾

2）胶塞的清洗：

清水浸泡→2%NaOH煮沸10~20min→冲洗→1%稀盐酸浸泡30min→充分冲洗→蒸馏水漂洗→烘干。

3）玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30min。

4）不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如移液器、多通道移液器的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2h以上。

二、细胞培养用水、用液

1.细胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿；

2.平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca2+、Mg2+离子的要避免其沉淀。

可过滤灭菌或高压灭菌。

采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10min及即可。

灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。

3.培养液的配制，以配制1000mlRPMI1640为例：

1）将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解；

2）加入5.94gHEPES，在磁力搅拌器上搅拌约30min；

3）加入2gNaHCO3，继续搅拌约2h；

4）定容至1000ml；

必要时用1MNaOH调至pH7.0

5）过滤除菌。

滤纸由上到下为：

普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；

6）加入抗生素液至每毫升100单位青霉素+100μg链霉素；

7）按需要加入一定比例的血清使用。

常用10%胎牛血清。

8）密封置于4℃冰箱保存。

超过一个月需补加谷胺酰胺（Gln）。

4.消化液的配制：

实验室采用0.125%胰蛋白酶溶液+0.01%EDTA

1）按0.25%的浓度计算所需的胰蛋白酶量，将称好的胰蛋白酶粉末置于烧杯中，用少许消毒的PBS液（或D-Hank液）调成糊状，再补足盐溶液；

2）搅拌均匀，置于4℃冰箱中1~2天，并不时搅拌振荡；

3）过滤除菌，分装成小瓶，置于-20℃冰箱；

4）按0.02%的浓度计算并称量EDTA，溶解；

5）高压蒸气灭菌，分装成小瓶；

4℃冰箱保存；

6）使用时将胰蛋白溶液与EDTA溶液按1:

1混合，混合液也可分装成小瓶，保存于-20℃。

5.冻存液的配制：

FBS+10%DMSO，可于4℃冰箱保存。

抗生素液的配制：

将青霉素及链霉素用三蒸水溶解，分别配成20万单位/ml及20μg/ml，再按1:

1混合，即为10万单位/ml青霉素+10μg/ml链霉素。

可于-20℃保存。

使用时按1ml培养基加入1μl抗生素液的比例使用。

三、细胞培养实验基本操作

1.细胞的复苏

非原代培养细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏：

1）实验准备：

将水浴箱温度调至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；

2）在记录本上查到所要复苏的细胞存于液氮罐中的位置；

3）从液氮罐中取出所要细胞，立即置于37℃水浴箱中，使其快速解冻；

4）将冻存管及培养液瓶的外表面用70%酒精擦拭后，放入超净台；

5）将细胞悬液移到离心管中，并加入2~3ml培养基，用吸管轻轻吹打；

6）1000~1500rpm离心3min；

7）吸去上清液，加入2-3ml培养液，吹打均匀，使细胞悬浮；

8）将细胞悬液移到50ml培养瓶中，补加约5-8ml培养液；

置于细胞培养箱或者中培养（拧松培养瓶盖）。

2.细胞的传代

培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。

这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

1）悬浮细胞的传代

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。

当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3min，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。

然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。

2）贴壁细胞的传代

（1）将消化液从冰箱中拿出，37℃解冻、预热；

（2）吸出全部培养液，沿壁缓缓加入消化液，将培养瓶有细胞面向下，加入消化液的量至刚好可以覆盖为止，轻轻摇晃；

（3）置于37℃消化2~5min，期间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱落即可停止消化，以防消化过度；

（4）加入2~3吸管含血清的培养液，终止消化；

用吸管轻轻吹洗培养瓶有细胞的一面，以使细胞脱落干净；

（5）细胞悬液转移至离心管内，1000～1500rpm离心3min；

（6）弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

3.细胞的冻存

细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。

1）贴壁细胞经消化、离心收集，悬浮细胞经离心收集；

2）大约106个细胞加入1ml冻存液，用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；

3）加入到冻存管中。

如用1.8ml的冻存管，每管最好不要加入超过1.5ml的细胞悬液；

4）在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；

5）用厚布或卫生纸包裹冻存管，置于4℃半小时，然后置于-20℃2h，再置于-40℃2h，然后置于液氮上方过夜；

第二天将细胞置于液氮中；

6）记下冻存管存放的位置，作好冻存记录。

四、倒置（荧光）显微镜使用（Inverted/Fluorecentmicroscope）

倒置显微镜是一种把照明系统置于载物台上面，把物镜置于载物台下面的显微镜，这种显微镜由于大大加长了载物台上防止样品的高度，可以防止培养器皿，因此多用于观察培养的活体细胞和组织。

倒置显微镜的组件有1灯泡、2聚光镜、3隔热玻璃、4观察物、5物镜、6直角棱镜、7场镜、8辅助物镜、9半角棱镜、10双目棱镜、11目镜、12摄影分光棱镜、13摄影目镜、14摄影底片、15摄影调焦物镜、16分划板图、17摄影调焦目镜。

倒置显微镜光学原理图

1、使用方法

1）将各倍率物镜由低倍至高倍顺序装上物镜转换器，目镜插入目镜筒。

2）接通电源，根据需要旋转调压器旋钮，可使照明灯泡电压变动，从而使光束亮度从弱到强变化。

3）将培养器皿置于载物台，拧松弹夹调节螺丝，调整弹夹位置，夹牢培养器皿。

4）调节光瞳间距，在使用双目或三目镜座时，两手分别握住目镜筒下方有滚花处，推近或拉开两个目镜筒，使两目镜筒距离适应两眼的瞳孔距，然后旋转左目镜，使到刻度环所对刻度与两目镜筒示距刻度相符。

旋转粗调旋钮，使载物台缓慢下降，直到用右眼在右目镜看见观察物的像；

顺时针方向振动粗调限位环，此时，粗调旋钮不能再使载物台下降，然后旋转微调旋钮使观察到的物象清晰为止。

旋转左目镜，进行视度调节，使左眼在左目镜所观察到的物象也同样清晰。

5）使用载物台的同轴旋钮，寻找所需观察物点。

2、注意事项

1）有的倒置（荧光）显微镜在普通光下，可作为相差显微镜使用。

2）在使用紫外光源时，可对发荧光的物质，或荧光染色的物质进行观察。

3）目镜为10×

，物镜配有20×

和40×

两种，因此最大放大倍数为400倍；

4）配有三个滤光镜，波长分别为340-380nm，450-490nm，515-560nm，可按需要选择所需的激发光波长。

5）配备手动或者自动摄影系统。

6）使用时注意清洁，要严格防止样品触到镜头，防止样品中的液体沾到放样台及镜头上。

7）调焦时勿用力过猛，先粗调，后微调。

8）若使用时间很长，则应中间适当关闭休息。

若内部过热，光源会自动关闭，此时应耐心等待。

9）勿用手触摸镜头及滤光镜的玻璃面，发现镜头或滤光镜上有污点应用镜头纸擦拭。

五、超净工作台的使用

超净工作台是细胞培养不可缺少的无菌操作装置。

净化台（超净工作台）的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

风速为0.32米/秒，处理40min，工作台内即可形成高洁净的工作环境。

工作台侧面配有紫外线杀菌灯，可杀死操作区台面的微生物。

超净台按气流方向的不同大致有2种类型：

1、侧流式：

净化的气流从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，也有从上往下或从下往上流向对侧流动，它们都能形成气流屏障面保持台面无菌，它的缺点是：

在净化气流和外边气体交界处，可因气流的流动出现负压，使少量的未净化气体混入，而造成污染。

2、外流式：

气流是面向操作人员的方向流动，从而保证外面的气体不能混入。

它的缺点是：

在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机玻璃把上半部遮挡起来，使气流经下方流出。

净化台使用注意事项：

1、净化台宜安置在清洁房间（无菌室）内，尘土过多易致滤器阴塞，降低其净化作用，并影响高效滤器寿命。

2、根据净化台周围环境的洁净程度，定期（2-3个月）将粗涤纶滤布清洗或更换。

3、定期（一般1周）对环境进行清扫和灭菌工作。

经常用沾有酒精或丙酮等有机溶剂的纱布擦拭紫外线杀菌灯表面，保持其表面清洁，否则影响杀菌效果。

4、净化台工作时，平均风速保持在0.32-0.48米/秒之间，电压调在100V处。

风速出厂前已调节好，不要随意转动调压器旋钮。

若酒精灯火焰不动，说明风速未达到要求，加大电压后风速达不到0.32米/秒时，必须更换高效过滤器。

5、使用前，超净台开紫外杀菌灯照射15-20min，可把操作过程中所需要使用的一些器材放进去一同照紫外。

6、使用完毕请将个人的东西清理拿走，并清洁台面。

较多人使用时，可事先预约安排好时间，以免发生冲突。

实验报告格式：

（参考）要手写

实验名称：

细胞生物学实验

——昆虫细胞培养技术

姓名：

班级：

学号：

实验日期：

成绩：

一、实验目的

1、

2、

二、实验材料

三、实验方法与步骤

四、实验结果分析

五、讨论