蛋白质工程重点Word格式.docx

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3’

Removeprimers

Denatureandanneal

DNAcloning

（正向引物）

　（反向引物）

　　　　　　　　　　　（第一轮PCR,共有4种产物）

　（引物退火变性延伸）　

（只能5’　　3’方向聚合）

　　　　　　　　　　（用ＤＮA聚合酶扩增至完整链）

　　　　　　　　　　　　　（第二轮PCＲ）

　（用两端引物扩增目的基因）

由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.

3、蛋白质结构测定方法的优缺点

　　１）、蛋白质结构测定方法:

X射线晶体结构测定、核磁共振波谱法（NMＲ）、三维电镜重构。

2）、X射线晶体结构测定:

优点：

分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性的大量信息；

缺点：

①晶体构象是静态的,不能测定不稳定的过渡态的构象；

②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶;

（瓶颈）③X射线晶体衍射的工作流程较长。

　核磁共振波谱法（ＮMR）:

优点:

①同样具有高分辨率

②可以在溶液中操作,接近生理状态　

③分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理

　缺点:

①样品的分子量要比较小（50KD以下）

②对不溶的蛋白比较困难（如膜蛋白）

③实验周期长（>

1年）

三维电镜重构：

　　优点：

1.可以直接获得分子的形貌信息；

2.适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品（如难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等）；

３.适于捕捉动态结构变化信息;

4.易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；

５.电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方便。

①最大的缺点是分辨率较低

②对小分子蛋白效果不佳

4、X射线晶体结构测定原理、步骤及优缺点

1）、原理：

1.光的衍射现象

2.X射线的发现及应用

3.晶体学基础知识

4.Ｘ射线晶体衍射

⏹光的衍射现象

衍射现象:

光波偏离直线传播而出现光强不均匀分布的现象

⏹X射线的发现及应用

⏹本质的争论（波动说微粒说）

⏹X射线衍射的发现

⏹晶体学基础知识

⏹X射线晶体衍射

　2）、Ｘ射线晶体结构测定基本过程：

①蛋白质获取（提纯）

②晶体生长并经冷冻技术处理

③重原子衍生物制备

④衍射数据收集

⑤衍生数据分析和改进

⑥结构模型的获取（包括修正）

　3）、优缺点:

分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整

性的大量信息；

①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；

③X射线晶体衍射的工作流程较长。

三、简答题（有些没听到）

１、空间结构组件及其特点

α螺旋（αhelｉx）、Β折叠（βｓheet）、环肽链（loop）、转角（turn）

1）．α-螺旋　结构：

•多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构.

•肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行（同一方向），具有极性，Ｎ（＋）、Ｃ（-）　。

•中心无空腔,稳定

•蛋白质分子为右手α-螺旋。

（选）

•螺旋一周,沿轴上升的距离即螺距为0.５4nm,含3．６个氨基酸残基;

两个氨基酸之间的距离为０.15nm;

•沿主链计算，一个氢键闭合的环包含1３个原子，3.613

•螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧主要集中疏水残基

•对生物活性具有重要作用

•可用螺旋转轮（heliｃaｌwｈeel）的方式预测两亲性

　2）、Β折叠:

•伸展的构象,每圈只有2个氨基酸残基的特殊螺旋

•α-碳原子处于折叠的角上,R基团处于棱角上与棱角垂直,两个氨基酸之间的轴心距为0.3５ｎm

•β折叠片也是一种重复性的结构，可以把它想象为由折叠的条状纸片侧向并排而成。

肽主链沿纸条形成锯齿状。

•氢键是在片层间而不是片层内形成。

•折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面,并交替地从平面上下二侧伸出。

3）、转角（tｕrn）

回折（ｒｅｖerseturｎ）

　　　　　β转折（转角）（β-ｔurn）

　　　γ转折（γ-turn）

β发夹

　　　β发夹（β－haｉｒpiｎ）

　　　　　无规则卷曲

2、蛋白质的空间结构层次

一级结构、二级结构、结构模体、结构域、三级结构/亚基、四级结构。

3、第二遗传密码的定义及其特点

定义：

无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分—遗传密码的第二部分，

蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系,称之为第二遗传密码或折叠密码。

特点:

简并性

氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。

•多意性

相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。

•全局性

在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；

后形成的肽段可以影响已经形成的肽段个构象从而造成对分子整体的影响等。

4、表达系统宿主的选择:

　体内翻译系统

　　体外翻译系统：

原核生物表达系统：

大肠杆菌、枯草杆菌

　　　　　　真核生物表达系统：

酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统

５、大肠杆菌表达载体的组件

复制起始点、选择性基因、多克隆位点（ＭCＳ）、启动子（Prｏmｏｔer）、终止子（Terminａtor）、核糖体结合位点（ＳD序列）

四、其他

一）、蛋白质工程绪论

1、蛋白质工程化的顺序:

工程化:

理念－设计-制造－功能实现

２、基因工程和蛋白质工程（选）

基因工程

蛋白质工程

相同点

都要改造基因，都属于分子水平

产生的基因（型）

无新基因（型）

有新基因（型）

产生的蛋白质

原有的

新的

联系

蛋白质工程以基因工程为基础，

是基因工程的应用和延伸

3、酶工程与蛋白质工程的区别

•酶工程:

酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备。

•蛋白质工程:

重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。

4、蛋白质工程产生的标志、研究内容、支撑技术

1）、１983年，美国的Ulmer在《Ｓcieｎcｅ》上首先提出了“ＰｒoｔeinEngｉｎeering“——蛋白质工程诞生（Science，2１９:

66６-67１.　）

2）、1.　蛋白质结构分析

　　　　　——基础

2.结构、功能的设计和预测

　　　——基础的应用与验证

3.创造和／或改造蛋白质——新蛋白质

　　　——终目标

3）、蛋白质结构解析技术、生物信息学分析技术、定点突变等遗传操作技术

二）、蛋白质结构基础

５、氨基酸的构型与构象及多肽链构象的表征参数

•构型configuratｉon：

一个分子中原子的特定空间排布（L-型的单一手性分子）

–构型转化时必须有共价键的断裂和重新形成

–不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重合

–化学上可以分离，不可由单键旋转相互转换

•构象coｎｆｏrmatｉon：

组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布

–构象转化时不需要共价键的断裂和重新形成

–化学上难以区分和分离

表征参数:

（1）多肽链的构象角　（φ，ｙ）

（2）拉氏构象图（Raｍａchandｒaplot）及多肽链构象的允许区

6、可用螺旋转轮（heliｃａl　wheeｌ）的方式预测两亲性

7、β折叠的几种形式:

平行型/反平行型、混合型（选）

8、蛋白质的一级结构:

多肽链中氨基酸的排列顺序,二硫键的数目和排列方式

9、维系蛋白质结构的作用力:

肽键、二硫键、氢键、离子键、疏水键、范德华力

维持蛋白质一级结构的作用力是：

肽键、二硫键

三）、蛋白质折叠

１0、20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性的牛胰ＲNaｓe在不需其他任何物质帮助下,仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然结构的实验结果，提出了“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”的“自组装学说”。

证明了一级结构决定高级结构。

Anfiｎｓｅn的贡献：

氨基酸序列决定空间结构-蛋白质折叠的热力学

　　第一个发现了二硫键异构酶

　　亲和层析纯化蛋白

　　　合成葡萄杆菌核酸酶-固相合成

11、体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的区别

•完整肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠,与新生肽链的合成延伸与折叠同时进行的不同。

•细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。

•温度、浓度、pH值不同

•细胞和试管另一个重要差别是“大分子拥挤”问题。

12、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子

•分子伴侣（mｏｌecｕlaｒcｈaｐeroｎe）

•折叠酶：

催化与折叠直接有关的化学反应的酶。

–蛋白质二硫键异构酶（ＰDI）

–肽基脯氨酰顺反异构酶（PPＩ）

１３、分子伴侣与酶的异同点及作用机制

1）、分子伴侣与酶的异同点

–相同点

•参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现

–不同点

•分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性

•分子伴侣的催化效率很低

•分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。

2）、作用机制

•识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然结构。

与这些中间物结合，生成复合物，防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径，抑制不可逆的聚合物的产生，促进折叠向正确的有效的途径进行。

•分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然构象。

•分子伴侣与早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合；

一旦聚合形成，分子伴侣就无能为力了。

14、蛋白质的质量控制系统（选）

•蛋白质是生物体内一切功能的执行者。

•蛋白质的错误折叠可以导致一些疾病。

•为保证细胞的正常活动，细胞通过各种层次的“质量控制”来识别、纠正和防止错误的发生。

１5、折叠病与构象病的区别（选）

•“分子病”:

由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况，如地中海镰刀状红血球贫血症。

分子病不是构象病。

•“折叠病”:

蛋白质分子的氨基酸序列没有改变,只是其结构或者说构象有所改变引起的疾病。

四）、蛋白质的理化性质

16、蛋白质的理化性质：

１）、蛋白质折叠过程中会打破水的有序化,则ΔＳ溶剂为较大的正值,因而有利于折叠态。

2）、对于典型的蛋白质来说,对折叠结构的稳定性做出单项最大贡献的是疏水残基引起的ΔS溶剂。

３）、蛋白质的稳定性主要指蛋白质的物理上（热力学）的稳定性,而不是化学稳定性。

4）、与蛋白质折叠相关的焓有两个:

–通过平衡常数算得的Ｖan‘t　Hofｆ焓，　DHＶH

–通过量热法获得的量热焓,ＤHcal

如果DHVH＝ＤＨcal，表明在Tm处没有中间体的存在,系统属于两态转变

五）、蛋白质分子模拟与设计

１7、设计层次、分类

Ø

“小改”：

定位突变和化学修饰

“中改”：

结构域进行拼接组装

•全新蛋白质设计（“大改”）

–完全从头设计全新的蛋白质

　　——基于某些理论和研究结果，设计出初始分子模型

——设计循环

18、蛋白质设计的目标及解决办法

　　　设计目标

　　解决办法

热稳定性

对氧化的稳定性

引入二硫桥

增加内氢键数目

改善内疏水堆积

增加表面盐桥

把Ｃｙｓ转换为Ala或Ｓer

把Meｔ转换为Gln、Val、Ｉｌｅ或Leｕ

把Trp转换为Phe或Tyr

1９、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸的构象特征

•分子量都比较小

•灵活性Gly＞Aｌa>

Pｒｏ

•甘氨酸具有高度柔韧性,可在α螺旋、　β折叠处出现，但更常见于铰链区或β　转角。

Ｇly在定点突变时，一般不宜随意改变

•Ｐro比较刚性，常出现在β转角

•Alａ处于二者之间,常用作取代别的氨基酸的首选。

20、Janus－真正符合Paracelsus挑战的蛋白

六）、蛋白质修饰

2１、基因融合与基因连接的方法及用途

方法:

通过限制性内切酶、通过无义突变产生的限制性内切酶、重叠延伸ＰCR

　用途:

1）、单分子活性组合

　2）、检测和提纯

　　3）、提高基因表达量和增溶作用

　４）、细胞定位

22、非天然氨基酸的引入方法（tRNＡ介导的蛋白质工程）

１）、在体内引入氨基酸类似物

２）、氨酰化tRNＡ半合成酶介导体内外翻译

３）、非天然氨基酸tRＮA合成酶／tＲNA对介导的蛋白质工程

复制起始点、选择性基因、多克隆位点、启动子、终止子、核糖体结合位点

七）、蛋白质的分离纯化与鉴定

2３、与蛋白质分离纯化相关的理化特性

•蛋白质的溶解特性:

盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法

•蛋白质的分子大小:

透析、超滤、凝胶过滤、离心

•蛋白质的带电特性：

电泳、离子交换层析

•蛋白质的吸附性质

•蛋白质与配体特异性结合不同：

免疫亲和层析、生物亲和层析、金属螯合亲和　　层析、拟生物亲和层析

•蛋白质的分子形状

•蛋白质的变性和复性

24、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤

•总原则

–以合理的效率、速度、收率和纯度,将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来,同时仍保留其生物学活性和化学完整性。

•步骤

–选择实验材料,实验材料预处理

–蛋白质的提取

–蛋白质的粗分级

–蛋白质的细分级

–蛋白质的鉴定　

2５、蛋白质的粗分级、细分级方法

粗分级：

1）、使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩,同时去除大量的杂质，这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。

2）、硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。

细分级:

1）、粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。

2）、常用技术:

层析（分子筛层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析）和电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰAGＥ）、ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS--PAＧＥ）、等电聚焦电泳（IEF）、双向电泳）

26、不连续PAGＥ分离蛋白质的原理（选）

–电荷效应

–浓缩效应

•快慢离子效应

•凝胶浓度差效应

–分子筛效应

2７、镍离子层析方法属于亲和层析

八）、蛋白质结构测定

28、Ｗesterｎ　Blｏt基本原理与步骤

基本原理:

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。

一般流程：

　蛋白样品的制备、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、抗原抗体显色反应。

具体步骤：

转膜、封闭、一抗杂交、二抗杂交、底物显色

２９、晶体的初步鉴定（选）

小分子晶体

蛋白质晶体

边界

完整，漂亮

常不完整,易出现多晶

硬度

偏硬，易碎成2瓣或几瓣

偏软，易碎成粉

脱水

不变化

因脱水而变坏

溶解性

慢

快

偏光性

强

相对弱

染色性

弱

漂浮性

下沉

漂浮

30、共振条件

（1）核有自旋（磁性核）

（2）外磁场,能级裂分；

（3）照射频率与外磁场的比值ν0　/H0=γ/（2ｐ　）

　——外加射场的频率与原子核自旋进动的频率相同

31、电子显微技术的最大缺点是分辨率较低

谱图中化合物的结构信息

（1）峰的位移（δ）:

每类质子所处的化学环境,化合物中位置;

（２）峰的裂分数:

相邻碳原子上质子数；

（3）偶合常数（Ｊ）:

确定化合物构型。

（4）峰的数目:

标志分子中磁不等性质子的种类，多少种;

（5）峰的强度（面积）：

每类质子的数目（相对）,多少个;

不足之处：

仅能确定质子（氢谱）。

九）、蛋白质组学

32、HＰP里程碑

•两谱:

蛋白表达谱、修饰谱

•两图:

蛋白连锁图、亚细胞定位图

•三库：

样本库、抗体库、数据库

33、蛋白质组研究整体技术的特点：

规模化、通量化、自动化

技术目标（要求）:

有效分离、准确鉴定、合理分析

34、蛋白质组学研究的手段

•蛋白质组研究的核心──用于分离的双向电泳（2-ＤE）

•蛋白质组技术的支柱———鉴定技术（Iｄentｉfiｃａｔｉｏn）

•蛋白质组研究的百科全书———数据库（databasｅ）

3５、生物质谱技术

☐原理:

将样品离子化,根据不同的质量和电荷差

　　　　异确定分子量的技术

☐应用：

蛋白质序列分析

　　　　蛋白质修饰分析

☐最重要的鉴定技术（支柱）

36、质谱仪组成：

进样器、离子化源、质量分析器、离子检测器、控制电脑、数据分析系统

离子源

•电子碰撞

•快原子轰击

•电喷雾离子化

•基质辅助激光解吸附

质量分析技术

•飞行时间质谱ｔime-ｏf－fｌiｇｈt,TOF

•离子阱质谱iｒｏnｔraｐ，IT

•四极杆质谱quaddrupole,Q

•傅立叶变换离子回旋共振质谱fouｒiertｒaｎｓｆoｒｍioｎｃyclotｒoｎ,ＦrICR

十）、蛋白质芯片、蛋白质结构预测及表面展示

37、生物芯片的标准（多选）

有规则（ｏrderｅd）

显微尺度（micｒｏｓcoｐｉc）

平面的（plａnar）

特异性地吸附（sｐecific）

3８、目前常用的生物芯片制作方法:

接触点样法、喷墨法、原位合成法（主要是美国Ａffｙmeｔrｉx公司开发的）

39、探针的标记:

荧光标记（常用Cy3绿色、Cy5红色）:

cy3标记ｃa