感受态制备Word文件下载.docx

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5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入100μl预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；

7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

8．弃去上清，加入100μl预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

以上是基本步骤，基本同“分子克隆指南”，具体的体积（一次制作感受态细胞的量）由个人根据实际情况掌握，不一定要死守以上的体积，但要保持试剂、菌体等量的平衡。

提高感受态效率的关键如下述――

注意事项：

1.克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板；

2.菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超过0.6；

3.低温处理的时间，做完后冰上保存12到24h后分装，并保存于－80℃；

4.试剂和用品，非如果有可能，所有的用品（离心管、摇瓶等等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl2溶液要过滤除菌，不要高压灭菌。

二、电转感受态细胞的制备

1、-80℃冰箱保存的菌种在SOB固体平板上划单菌落；

2、次晨，挑选单克隆感至内含1mlSOB液体培养基的试管中，37℃，300rpm，6hr；

3、然后转接到含400mlSOB液体培养基的2L摇瓶中（按1:

500的量转接），300rpm，4hr，然后每隔2min测一次OD600，至OD600=0.76；

4、立刻置冰水浴中骤冷，可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器里快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来；

5、随后在250ml预冷的离心杯中离心，4℃，2000g，10min；

6、弃上清后，用预冷的水（灭菌的重蒸水）洗：

先加少量水悬浮菌体（具体办法：

在一个大的装有冰水混合物的容器里旋转摇动离心杯使菌体悬浮），菌体悬浮后再把水加满，2200g，10min，弃上清；

7、再用10%的甘油同样方法洗两次，2400g，10min；

8、最后一次倒尽甘油后（尽量去干净），用残存在管底的甘油悬浮细胞，每120μl分装到1.5mLEp管（EP管要-70度预冷），用-70℃的乙醇迅速冰冻；

9、保存在-80℃冰箱中备用。

以DH10B为例说明：

步骤1：

每次做感受态都要新鲜划菌，不要使用保存于4℃或室温的平板；

尽量使用原代菌，最好不要用多次传代的菌；

LB平板也可以，但效率可能会降低；

SOB使用GIBCO公司的试剂配制，效果最好；

但若电转的连接子为一般性载体，使用普通的试剂配制培养基即可；

步骤2：

该步骤与步骤3中出现的数字存在相关性，条件允许的话尽量按照要求做，不允许的话则按照实验室实际情况稍做修改，确保菌体生长良好；

步骤3：

确保OD达到要求，宁可低一点，也不要高一点，建议在达到0.5后过2-3min就测一次OD值；

步骤4：

一定要在冰水混合物中快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来，不要静置于冰水混合物中，摇动大约10min；

步骤5：

建议使用离心杯，因为其底是平的，并且灭菌时里面要装上双蒸水,利于步骤6，7与8中的悬浮操作；

步骤6：

悬浮菌体时不要使用移液枪，开始时加入的水量要少，避免过多，等菌体重悬起来以后再加满。

用手摇动时保证培养基液面低于冰面，重悬过程中注意悬浮的菌团出现，需将其全部分散开；

步骤7：

同上

步骤8：

尽量倒尽甘油，使感受态更浓，每400ml培养物制备1-1.5mL感受态为益；

关于EP管预冷与-70℃的乙醇迅速冰冻的具体办法：

在菌种保藏盒内加入适量的乙醇，再把空的EP管盖上帽子后放入其中，置于-70度冰箱（或-80℃冰箱）预冷，分装感受态的时候将其取出（连带保藏盒），在超净台分装，分装时使用灭菌并剪去尖头的枪头，尽量使用1ml蓝色大枪头。

完成后置于-80℃冰箱；

步骤9：

关于保存感受态的温度，-70℃、-80℃皆可，建议实验室现有的温度最低的冰箱；

以上方法适用于很多E.coli菌株，例如：

XL1-Blue，DH10B，DH5α，Top10，JM109，BL21等做电转感受态，可能不同的菌株生长速度有差异，方案中的培养时间与最佳OD值可能有变化，不妨用此方案尝试一下，如果效率不够高的话可以对所用的菌株进一步进行优化。

注意：

1.所用的摇瓶和离心管要洗的特别干净，禁用任何洗涤剂，用NaOH溶液洗数次；

2.重悬菌体用手振荡，不用振荡器；

3.用枪吸打要轻，枪头需要剪去尖头；

4.如果做的效果好，效率可以达到10*10以上。

对于E.coli感受态制备，以上实验方案都要特别注意：

所有的容器要用新的，不用洗涤剂，用手洗且保证彻底干净；

相应的器材要作为制备感受态细胞专用，不做其他用途；

试剂要选用最好的，尽量过滤除菌，不用高压灭菌等等。

因为电转化效率更高，对要求转化率的实验，建议采用电转化的方法。

附件1.

晶美公司高效感受态细胞制作方法：

版权归晶美公司所有，仅供大家参考！

方法一

A液：

1M，MnCl2：

B液：

1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液称取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。

将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液（46ml）中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。

划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100mlSOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4mlTB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280mlDMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5mlEP管，冰上静置15分钟。

用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。

取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。

无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。

涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。

整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。

对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。

现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。

要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《gene》上刊登的由InoueH.等提出的高效感受态的制备与转化方法。

根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。

1、所用器具的洁净程度。

这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。

2、培养基的装量：

培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。

厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。

建议装量不要高于此值为：

培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。

3、培养基的pH值。

这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。

一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。

这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。

4、培养后的OD值。

其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。

同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。

5、培养基中的各种离子。

经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。

在制备普通感受时，使用20mMMgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

6、培养温度。

文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。

7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。

至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。

方法二

1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLIDH5,JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.

2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个,接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基.培养基量不可再多,会影响效率.

3.在18度150-250RPM培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温,但不可高于37度.

4.OD600约0.4-0.8时停止培养,放在冰水中冷却10分钟

5.4度,300RPM离心15分钟,回收菌体

6.去掉上清后,用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮,在冷10分钟

7.再次离心回收菌体

8.用1/12.5体积的TB悬浮,添加最终浓度为7%的DMSO,再冷却10分钟

9.0.1-1毫升分装,直接在液氮中冻上.

10.在液氮或-80度保存.

附件2.小木虫发布的高效感受态细胞的制作

小木虫网站所有，供大家参考。

作者:

noah

洁净是最重要的。

预冷是必要的。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。

现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。

方法三

（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。

（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。

（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

（4）用预冷的TBBuffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

（5）重复第4步操作。

（6）用8mL预冷的TBBuffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7%。

（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。

本法效率极高,建议大家采纳

方法四

1.单菌落-------2mlLB37度120RPM过夜------1%转接-------37度200RPM2小时（OD到0.4~0.5）

2.2ml,冰浴15min,4度,6000RPM5min,弃上清,悬浮于1ml0.1MCaCl2中,冰浴20min

3.4度,6000RPM10min,重悬浮于200ul0.1MCaCl2中,冰浴30min

建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。

方法五

E.coli感受态细胞制备方法:

单菌落平板至2mlLB,37℃250r/m,1ml转至50mlLB,37oC250r/m至A600=0.2-0.4

离心后用10毫升TSS重悬后,分装-70oC保存。

尽量冰上操作.

转化:

加质粒（&

lt;

5ul/100ulcell）后冰上30分钟，42℃90秒，冰上2分钟，加LB至1ml,37℃1小时后铺抗生素平板。

TSS:

7.0mlpH6.1LB

2.0ml50%PEG6000

0.5MLdmso

0.2MLMg2+（0.1ml1mol/lMgCl2and0.1ml1mol/lMgSO4）

0.3mlddH2O

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化

以枯草芽孢杆菌168（Bacillussubtilis168）为例

枯草杆菌化学感受态制备及转化方法

C培养箱培养121.准备新鲜的168单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37h；

C，250r/min培养过夜；

2.转化前一天晚间挑单菌落至3mlLB培养基中，37

3.第二天上午取160μl培养液转接至8mlC，250r/min培养至对数生长末期（168约4-5h）；

SPI培养基中，37

4.取0.2ml生长至对数期末的培养液至2C，100r/min培养90分钟；

SPII培养基中，37

l10mmol/L5.在上述SPII培养基的菌体中加入20C，100r/min培养10分钟；

EGTA，再于37

l6.将上述处理后的菌液分装成0.5ml每管，各加入5C，250g），再于37DNA（DNA量不能过高，不超过5r/min培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。