毛细管电泳发展历史综述Word格式文档下载.docx

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以直径为100μm的铜微电极为工作电极，于电极电位+0.8V（vs.Ag/AgCI）处，40mmoI/L的Na2B407（pH值为13.4）min为缓冲溶液时,氯原酸与黄苓苷在12min内得到良好的分离.氯原酸与黄苓苷分别在5.0×

10-3~0.5mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈良好的线性关系,检测下限分别为1.0×

10-4mg/ml和5.0×

10-5mg/ml。

2.用毛细管电泳安培检测同时测了复方芦丁片中芦丁和抗坏血酸的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到优化的条件。

以直径为50μm的碳纤微电极为工作电极，电极电位在+0.8V（vs.Ag/AgCI）,40mmoI/L的Na2B407-H3BO3（pH值为7.5）为缓冲溶液时,芦丁和维生素C在10min内得到了良好的分离,芦丁和维生素C分别在5.0×

10-8~5.0×

10-4g/mL、8.0×

10-4g/mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系，其检测下限分别为2.0×

10-8g/mL、5.0×

10-8g/mL。

3．用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药连翘中连翘苷与芦丁的含量，研究了各种实验效果的影响，得到了优化的实验程序。

以直径50μm的碳纤维微电极为工作为电极，电极电位在+1.2V（vs.Ag/AgCI）,20mmoI/L的Na2B407-H3BO3（pH值为8.4）+40mmoI/LSDS为缓冲溶液时,芦丁和连翘中连翘苷在10min内得到了良好的分离.芦丁和连翘苷分别在为1.0×

10-3mg/mL和5.0×

10-4mg/mL.

4、用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药槐花中芦丁和槲皮素的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验步骤。

以直径为50μm的碳纤维微电极为工作电极，检测电位为+1.2V（vs.Ag/AgCI）,20mmoI/L的Na2B407-（pH值为8.4）+40mmoI/LSDS为缓冲溶液时，芦丁和连翘在10min内得到良好的分离。

芦丁和连翘苷分别在5.0×

10-3~0.5mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系，检测下限分别为1.0×

10-4mg/mL和5.0×

10-5mg/mL.

5、用毛细管电泳安培检测法同时测定丹参注射液中丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件。

以直径为50μm的碳纤维电极为工作电极，电极电位+0.8V（vs.Ag/AgCI）,20mmoI/L的Na2B407-（pH值为8.4）+40mmoI/LSDS为缓冲溶液.在此条件下,丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在10min内得到良好的分离。

丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在0.01~0.2mg/mL、0.002~0.1mg/mL和0.002~0.1mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系，检测下限分别为0.002、0.001和0.001mg/mL。

6、用毛细管电泳安培法同时测定了中药天麻中天麻素，对羟基苯甲醇和香草醛的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件。

以直径为50μm的碳纤维微电极为工作电极，电极电位为+1.0V（vs.Ag/AgCI）,20mmoI/L的Na2B407-（pH值为8.4）+30mmoI/L胆酸钠为缓冲溶液时,天麻素、对羟基苯甲醇和香草醛在12min内到了良好的分离。

天麻素、对羟基苯甲醇和香草醛分别在0.020~0.5、0.031~0.5和0.025~5.0mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好线性关系,检测下限分别为0.005、0.01和0.006mg/mL。

7、用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药儿茶中儿茶素和表儿茶素的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件。

以直径50μm的碳纤维微电极为工作电极，电极电位为+0.9V（vs.Ag/AgCI）,20mmoI/L的Na2B407-（pH值为8.8）+80mmoI/LSDS为缓冲溶液时,儿茶素和表儿茶素在10min内得到了良好的分离.儿茶素和表儿茶素分别在5.0×

10-2~1.0mg/mL和5.0×

10-2~2.0mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈良好线性关系,检测下限分别为0.02mg/mL和0.01mg/mL。

通过以上工作，证明所设计的高压电场隔离接口和安培检测池能够满足实际工作需要，希望能对毛细管电泳安培检测方法学的研究起到一定的促进作用，对安培检测技术的发展有一定的帮助。

第一节毛细管电泳的历史与发展

传统的电泳作为一种分离技术,是根据在电场作用下,不同的溶质由于其不同的迁移速率,以不同的迁移速度向其所带电荷的相反方向移动,从而使得不同的溶质得以分离的方法.而毛细管电泳（CE）又称之为高效毛细管电泳（HPCE）,则是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，其迅速发展于二十世纪八十年代后期。

CE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使得分离分析科学从微升级水平进入到纳升级水平，并使得单细胞的分析，乃至单分子的分析成为可能。

与此同时，也使长期困扰我们的生物大分子如糖类、蛋白质等的分离分析，因为CE的产生和迅速发展而有了新的转机。

一．历史的简单回顾

溶液中荷电粒子在电场中的泳动现象，早在19世纪初就已被发现[1]，与色谱工作一开始就作为分析方法来研究不同，电泳在Michaelis[2]关于酶的鉴别工作之前，只是作为一种物理化学现象来研究。

在十九世纪中叶，对溶液中荷电离子的电场作用下的泳动现象，Wiedemann和Buff[3，4]开始进行研究，后来在实验的基础上，Kohlrausch[5]导出了离子移动的理论公式，描述了包括区带电泳，等速电泳和移动界面电泳在内的电泳基本理论，电泳在真正意义上进入分析化学是在Sverdberg和Tiselius[6]的开拓性研究之后，他们在1926年提出了移动界面电泳技术。

然而，只是在Tiselius[7，8]公布了移动界面电泳技术的细节之后，电泳技术才开始得到较为迅速的发展，并成为生物医学的基础研究手段之一，成功的应用于人血清的分离，获得了血清白蛋白等。

毛细管电泳发展的历史相当悠久，其发展可以追溯到二十世纪六十年代中期，瑞典科学家Hjerten[9]首先用内径为3mm的石英毛细管进行了电泳分离。

后来，Mikkers等[10]首先从理论上研究了电场聚焦现象及其对分离区带扩展的影响，随后在实验上用200μm内径的聚四氟乙烯管实现了高效电泳分离，这项研究成为CZE发展史上的第一个重大突破。

从二十世纪八十年代初开始，Jorgenson等[11，12]使用更细的毛细管及内径为75μm的熔融石英管做CZE，在30kV电压下每米毛细管的效率高达4×

105的理论塔板数，这一开创性的成果成为毛细管电泳发展历史上的一个里程碑，从此，毛细管电泳技术开始了突飞猛进的发展。

二．毛细管电泳技术的发展

1．分离模式的发展

传统的电泳模式只能用于荷电离子的分离。

1984年，Terabe[13]等在CE电解质溶液中加入离子表面活性剂，在溶液中形成离子胶束作假固定相，实现了中性离子的分离，这种模式称为胶束电动色谱（micellarelectrokineticchromatography，MEKC），此后，又相继发展了环糊精EKC，微乳胶EKC等[14，15]，目前，MEKC已成为应用非常广泛的电泳模式之一。

1983年，Hjerten[16]首先将聚丙烯酰胺凝胶毛细管用于CE分析，发展了毛细管凝胶电泳（capillaryelectrophoresis，CGE）。

CGE具有极高的分辨本领，可用于蛋白质碎片的分离及DNA序列的快速分析。

此后，随着毛细管电泳研究的深入，其它分离模式如毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF）[17]，毛细管等速电泳，毛细管电色谱（capillaryelectrochromatography，CEC）[18，19]等分离模式不断引入，极大的拓宽了毛细管电泳技术的应用范围。

2．基础理论的深入研究

CE涉及许多基本的理论问题，如区带展宽，塔板高度，热效应，电渗流，分离度的优化等，深入的对这些问题进入研究，将极大的推进CE技术的进一步提高与应用。

针对这些理论问题，国内外许多学者进行了大量的研究。

如Rhodes和Giddings等[20，21]对影响区带展宽因素进行了定量分析；

Andreev等[22]提出了一个数学模型，讨论了电渗流对CE效率的影响；

林炳承等[23，24]也对CE中各种影响区带展宽的因素进行了定量的分析，得到计算CE区带展宽的数学表达式，用计算机对多肽的CE分析进行了全过程模拟。

陈义等[25]比较系统的研究了毛细管电泳中存在的理论问题，讨论了电泳过程中物质传输的各种动力和描述方程、区带的迁移过程及其变化，各种影响分离效率的因素，并对毛细管电泳检测器及进样中的理论问题，进行了研究。

以上理论的提出，对毛细管电泳的实际应用具有重要的指导意义。

3．应用领域的不断扩展

与传统电泳一样，CE的主要应用领域是生命科学，分离对象涉及氨基酸，多肽，蛋白质，核酸等生物分子，对蛋白质结构分析具有重要意义的肽图，对人体基因工程具有决定性作用的DNA测序等许多当代生命科学中分离分析难题，CE都已涉及[26，27]。

在应用于生命科学的同时，CE近年来已迅速扩展到其它领域，包括食品化学，药物化学，环境化学，毒物学，医学和法医学等，特别是在手性分子和生物大分子的分离方面，CE具有独特的优势[28，29]。

4．仪器的不断完善

CE技术走向成熟的标志是其分析仪器的不断完善和商品仪器的出现，自1989年出现商品仪器以来，短短几年间，在世界范围内已推出十几种型号的商品化仪器，包括不少自动化性能指标都较完善的仪器，其检测方法也得到了发展，从广泛使用的紫外可见检测，到二极管阵列检测，激光诱导荧光检测，部分仪器还提供了质谱接口。

最近，电化学检测，特别是安培检测方法也得到了广泛的应用。

三．毛细管电泳的特点与应用

由于毛细管具良好的散热效能，允许在毛细管两端加上高至30kV的电压，分离毛细管的纵向电场强度可达到400V/cm以上，因而分离操作可以在很短的时间内完成，达到非常高的分离效率（理论塔板数达到400000/m以上，最高达107/m数量级）。

因为毛细管的内径很小（一般<

100μm），对内径50μm，长度为50cm的毛细管，其容积不足1μl，进样体积在nl级，样品浓度可低于10-4mol/L。

因此，毛细管电泳技术达到了仪器分析所要求的高效，快速，样品用量少等最基本和最优异的特点。

此外，毛细管电泳技术还有容易自动化，操作简便，容剂消耗少，环境污染小等优点。

正是这些特点的存在，使得CE—出现就被引起极大的关注，目前CE的研究已进入了一个重要的发展阶段。

作为一项新型的分离技术，CE的多种分离模式给样品分离提供了不同的选择机会，这对分离来源复杂的生物样品尤其有利。

研究表明，小至无机离子，大到整个细胞，都有可能利用毛细管电泳技术进行分离分析。

CE从产生到现在，其应用首先集中在氨基酸，糖类，核酸和蛋白质等生物分子的分离分析上，但是，随着此项技术的不断发展和完善，其应用已逐渐的向医药卫生，食品化工，环境等领域渗透。

目前，CE的研究热点包括：

DNA的高速测序[30]，蛋白质的高效分离[31]，糖类分析[32]，细胞分析，手性拆分[33~35]等等。

此外，毛细管电泳还可用于物理化学常数的测定，生产工程控制等。

四．毛细管电泳的未来

从毛细管电泳的发展趋势来看，目前的毛细管电泳越来越侧重于应用研究，特别是与生命科学相关的问题研究。

可以预见，随着生命科学研究的推进，毛细管电泳将面临新的机遇和挑战。

随着人类基因组计划的顺利实施和趋于成功，后基因组计划已经逐步展开，其中蛋白质组成的研究正引起广泛的重视，毛细管电泳作为高效和灵敏的分离分析方法，可能成为蛋白质组成研究的新工具。

利用毛细管电泳所进行的单细胞蛋白质组成探索性的研究结果显示，这是一个非常有前途的方向。

单细胞分析必然会快速发展，研究的目标为细胞内部物质。

单分子分析可能兴起并受到重视，但能否实现单分子分析是一个挑战性的课题。

此外，毛细管电泳的新原理，新方法也会出现，如何利用和吸收其他学科的原理，方法，技术也是推动毛细管电泳的发展所必须思考的问题。

总之，任何一种分离分析测定技术的发展都是朝着简单实用，同时又能解决实际问题的方向前进的。

第二节毛细管电泳电化学检测的研究

对于毛细管分离技术而言，极细的毛细管孔径虽然给这项技术带来了极高的分离效能，但同时也给检测器的配备带来了极大的困难，由于毛细管本身的内径极小，而被分离各组分又不能有显著的展宽，因此研制高灵敏度的检测器就成为毛细管电泳这项分离技术需要研究的重要方面之一。

目前已有许多种检测器被成功的应用于毛细管电泳技术中，但在商品化的仪器中常用的检测其主要是紫外检测器，紫外检测器受毛细管孔径的限制，致使其吸收光程很短，加之毛细管电泳进样量极小，导致紫外可见检测器的灵敏度相对比较低。

荧光检测器是另外一种比较常用的检测器，其突出的优点是灵敏度高，选择性好，尤其是激光诱导检测器，是目前最灵敏的检测器之一，但这种检测器仅能适用于具有天然荧光或易于进行荧光衍生的物质。

质谱检测法是另外一种灵敏度高，专属性强的检测器，而且能够提供分子结构信息，是毛细管电泳非常理想的一种检测器，但昂贵的价格限制了它的普及。

此外，毛细管电泳的检测方法还有化学发光法，拉曼光谱法等。

与上述一些检测方法相比，电化学检测方法已成为毛细电泳分离技术中一种重要的分离分析方法。

电化学检测方法包括电导检测，电位检测和安培检测三种，电化学检测特别是安培检测法具有灵敏度高，选择性好，线性范围宽以及设备简单，成本较低等优点，虽然由于其本身也存在一些不足，使其在实用性方面受到一些限制，但由于其具有前述显著的特点，毛细管电泳-电化学检测方法不仅在理论和检测技术方面有了长足的发展，而且已被广泛的应用于生物医学，环境科学，药物学，食品科学等领域中，成为分离分析科学中最具活力，最有发展前景的新的研究领域之一，有关这一方面的研究已有一些综述[36~38]，其中有的侧重于仪器和技术方面，有的侧重于应用方面。

下面参照有关文献，对毛细管电泳电化学检测的研究作一综述。

一毛细管电泳电化学检测（CE-ED）技术

对于毛细管电泳-电化学检测方法而言，其所包括的电导检测、电位检测和安培检测三种方法各有其特点。

电导检测虽然灵敏度相对较低，但其通用性好，适用于一般较小的离子的检测；

电位检测操作简单，适用于小的阴阳离子检测，但由于其容易致使峰变形，且重现性相对较差，使其在分析中应用较少；

安培检测虽然只对那些具有电活性的物质才有检出功能，但因其具备极高的灵敏度而得到了广泛的研究。

1电导检测

1．1电导检测原理

将电导检测法应用于毛细管电泳分离技术之中，是由于电导检测一般采用两个相对的金属电极指示电极检测水溶液中离子型溶质的电导，记录电导随时间的变化曲线就可得到电泳的分离谱图。

将电解质溶液至于施加有电场的两个电极之间，溶液将会导电，电导值L与电极的表面积A，电极之间的距离1以及溶液中各种离子电导的总和ΣLiλi有如下关系：

L=（1/1000）×

（A/1）ΣLiλi

电导测量中，A和1是固定的，1/A称之为电导池常数K，这时，

（1/K）ΣLiλi

而对于某一离子，

L=L0+（1/1000）×

（1/K）Liλi

1．2电导检测技术

毛细管电泳电导检测技术由于通用性得到了广泛的应用，尤其对那些不易被UV吸收进行检测的物质。

其发展至今有在柱检测，柱端检测，离柱检测三种形式。

电导检测应用于毛细管电泳之中，首先由Mikkers等[39]引入，他们在200μm的聚四氟乙烯（PTFE）管中分离了16中阴离子。

其后，Gebauer等[40]应用相似的系统分离检测了饮用水中NO-3，Cl-，SO2-4的含量，获得了10-6mol.L-1的检测限；

Firestone等[41]将其用于合成肽的纯度控制研究；

Avdalovic等[42]设计制作了一种能抑制电泳缓冲溶液背景电导的抑制柱，采用这种方法分析了13种阴离子和16种有机酸，检测限在2~10μg·

L-1。

柱后检测由于采用了接口而容易导致谱峰展宽，Huang等[43，44]开始探索毛细管电泳的在柱电导检测，他们以微机控制的CO2激光器在内径为75μm的毛细管壁上钻一个直径40μm的孔，然后与孔内相对安置一对25μm的铂丝作电极，避免了使用高压电场在两电极间的电位差，减少了背景电化学反应造成的噪音；

此外，他们还利用此方法获得了峰面积与保留时间有关系，通过加入内标的方法直接进行定量。

虽然在柱电导检测因没有接口，而具有区带扩散较小，灵敏度较高等优点，但在柱电导检测的电导池制作相当困难，为了使该方法更简便实用，Huang等[45，46]提出了柱端电导检测，此种设计使得检测变得相对简单。

运用这种方法可以检测金属离子，尤其是碱金属离子，以及有机胺，低分子量的有机羟酸和少量的氨基酸。

2电位检测

2．1电位检测原理

应用于毛细管电泳的电位检测法，其原理是基于电极电位的Nernst公式：

Ei=Eoi±

RT/ZiFlnai

Ei=Eoi+Silogai

Si=±

2.303RT/ZiF

其中，Ei为电极电位；

Si为理论响应斜率，实际测量时为实际响应斜率；

αi为所测离子的活度；

在实际应用中，涉及到样品浓度与活度的问题，但当维持样品溶液与标准缓冲溶液的离子强度相同时，即可以将活度系数合并入Eoi之中，这时上述公式就可以写成：

Ei=EoiSilogci

这里，ci代表所测离子的浓度。

当电泳组分区带经过电极表面时，将引起电位的变化，记录其随时间的变化曲线即可得到电泳谱图，电位检测简单快速，测量的线性范围宽，但是电位检测法的重现性较差，在较大分子离子的检测上存在一定缺陷。

2．2电位检测技术

Virtanen[47]首先引入了毛细管电泳的电位检测法，用于检测碱金属离子。

Harber等[48]引入了毛细管电泳柱端离子选择微电极电位检测法，将制作好的微电极置于毛细管末端几微米的位置，用于消除毛细管内由于高压电场引起的漂移电位和噪声电位，此方法除了Mg2+外，对大多数的阳离子均有较好的响应，因此Mg2+可以作为基体电解质用于碱金属和碱土金属离子的分离检测。

尽管柱端电位检测法操作简单，但由于其受热湍流的影响，电泳峰容易变形，且测定结果的重现性差；

为此，Nann等[49]设计了一种在柱电位检测，即采用氢氟酸蚀刻分离毛细管末端的内壁，使其成圆锥形，用于消除管内场强引起的漂移电位和噪声电位。

与此同时，他们采用在柱电位检测法，实现了在10μm的毛细管内无机阳离子及有机阳离子的分离检测，且获得了良好的重现性[50]。

与分离阳离子相对应，Hanser等[51]用尖端只有3μm的离子选择性微电极，在25μm的毛细管内同时分离测定了多种阴离子。

3安培检测

3．1安培检测原理

当被分离的化学物质流经电极表面时，由于溶质与电极之间存在着电位差，使得具有电活性的物质被氧化或还原，这时在溶液和电极之间就会形成电流，该电流符合法拉第定律。

电流经过放大检测，记录其随时间的变化曲线即可得到毛细管电泳谱图。

目前用于毛细管电泳安培检测的电极可分为柱状电极和盘状电极两类。

对于柱状电极，其尖端可看作是由平面电极和柱面电极组成，总的扩散电流由平面电极扩散电流iil和柱面电极扩散电流ii2组成[52]。

Iil由下式表示：

iil=4nrFDiCi

柱面电极部分可作为薄层处理，扩散电流可表示为：

ii2=5.00nFCiU1/3Di2/3r2/3（R-r）-2/3L2/3

上述两式中，n为得失电子数，R为毛细管的内半径，r为电极半径，L为电极长度，F为法拉第常数，Ci为被分析物的浓度，Di为扩散系数，U为平均体积流速。

总的扩散电流应为两者之和，即

ii=iil+ii2=4nrFDiC+5.00nFCiU1/3Di2/3r2/3（R-r）-2/3L2/3

而对于盘状电极，Jin和Chen等[53，54]导出了其电流响应公式：

i=nFCU[1-m1exp（-m2DA/bU）]rEf[Li/4（Dtm）1/2]

式中，U为体积流速，A为电极面积，b为电极与毛细管出口之间的距离，Li为进样长度，tm为迁移时间，m1和m2为常数。

3．2安培检测技术

在毛细管电泳的三种电化学检测方式中，安培检测法是三种模式中最容易实现，也是最普遍应用的一种电化学检测法。

在安培检测装置的研究和应用方面，人们作了大量工作，取得了很好的效果。

二毛细管电泳安培检测研究进展

当安培检测作为毛细管电泳的检测器时，由于用于分离的高压电场作用，分离电流比检测池中测量的电化学电流高几个数量级，它的微小波动都给电化学检测带来非常高的噪声水平（分离毛细管直径大于25μm），因此，如何有效的消除或降低来自分离电压的噪声是安培型电化学检测器设计的一个重要方面。

近来，采用连结器或柱端检测，隔离高电压的干扰，受到很好效果。

此外，通过电极设计的改变，亦使检测范围有所扩展。

1毛细管电泳安培检测装置的研究

围绕如何降低噪声，提高检测限，人们做了大量的