有机酸苹果酸的发酵生产工艺设计Word格式文档下载.docx

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能生产食醋的原料很多，如葡萄、苹果、麦芽、谷物原料、乳清等天然含糖原料皆可。

我国食醋生产的历史非常悠久，现已有多种风味和特色的食醋生产方法。

早先获得醋酸的方法有天然发酵醋的蒸馏和木材的分解蒸馏（所

谓“木醋”）。

真正的醋酸发酵应该说是从快速制醋法开始发展起来的，它是现代淋醋工艺的前身。

快速制醋工艺由德国学者舒莱巴赫在1823年首先提出，因此在国外称为“德国工艺”。

4、葡糖酸

1880年，Boutroux首先发现利用微生物的氧化作用，能将葡萄糖氧化成葡糖酸。

他发现用醋化醋杆菌能发酵葡萄糖产生一种不挥发酸，后来确定为葡糖酸。

以后许多研究者也相继报道，其他数种细菌也能产生葡糖酸或酮基葡糖酸。

本世纪30年代以前，细菌发酵是生产葡糖酸的主要方法。

1922年，Molliard发现，利用霉菌的氧化作用也能产生葡糖酸。

后来人们知道，黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有上述氧化作用。

Bernhager1942年发现，采取中和生成酸的方法，黑曲霉能高效地将葡萄糖转化成葡糖酸，而添加碳酸钙最好。

在

较低温度、限制氮源的条件下，生成的葡糖酸几乎可达理论产率。

我国在1955年由轻工业部上海工业试验所试制葡糖酸成功，选出了黑曲霉87号菌种，不久即在山东投入生产。

目前，我国已经有数家葡糖酸发酵工厂。

5、衣康酸

衣康酸（又称为甲叉琥珀酸、分解乌头酸）最早是由Baup1836年

蒸馏分解柠檬酸时发现的。

而微生物产生衣康酸的能力是日本人木下广野1929年在一种嗜高参压的霉菌培养物中首先发现的，他称之为衣康酸曲霉。

原来Raistrick通过对霉菌代谢物的长期研究发现，土曲霉表面培养时也能产生衣康酸。

我国的衣康酸生产尚属空缺。

金其荣等人于1984年开始着手对衣康酸产生菌进行选育和工艺条件的研究。

6、苹果酸

苹果酸广泛存在于生物体中，它在很多水果中是占优势的酸。

微生物产生苹果酸的能力也早已被人们所认识，早在1928年，Yuill就报道过，在培养黄曲霉时，有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。

Schreyer1931年报道，在丛花青霉的表面培养液中，生成的有机酸钙相当于耗糖的1/4，其中大部分是苹果酸钙。

Bernhauer等报道，在蔗糖为碳源的黑曲霉发酵液中，除生成大量的柠檬酸之外，也有少量苹果酸生成。

我国在发酵法生产苹果酸方面也有很大进展。

北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母的苹果酸生产技术。

福建三明真菌研究所试验过L-苹果酸的霉菌固体发酵。

6/1苹果酸的性质

苹果酸是一种较强的有机酸，又名羟基丁二酸，是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体。

晶体中不含结晶水，DL-型熔点129C,L-型熔点100C，加热到180C可以失水分解成富马酸或马来酸。

在通常条件下，苹果酸是稳定的，但其纯晶体稍有吸湿性，在高湿度条件下可能液化。

在相对湿度98%,25C下放置6天，约增重50.4%.

苹果酸在催化剂存在下与醇可发生酯化反应。

以三氟化硼为催化剂与醇回流可形成单酯。

与多元醇、芳香多元羧酸作用,可形成树脂类产品,如醇酸聚酯树脂。

在氧化银存在下,苹果酸酯与卤代烷反应可以产生醚类,如乙氧基琥珀酸。

在醇溶液中,苹果酸酯与氨作用,可以生成苹果酸酰胺。

6/2苹果酸的发酵机理

L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。

在一般生物中它只参与循环而不会大量积累,否则会造成代谢流的阻塞。

要想积累苹果酸,必须要有补充4碳酸的途径。

理论上讲,补充4碳酸的途径有两种：

乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。

实际上,苹果酸的生物合成机理虽然早就研究得很清楚,但它只是从生物生理学的角度去研究的。

对于微生物发酵中苹果酸合成机理尚没有进行过细致研究。

一般认为，苹果酸发酵牵涉到CO的固定（即丙酮酸羧化），其证据有：

发酵依赖于CaCO或其他碳酸盐，添加生物素可以促进苹果酸积累等。

但是，CO2固定反应在各种菌的发酵中究竟占多大比例还未见有报道。

毫无疑问，无论有无乙醛酸循环存在，提高丙酮酸羧化的比例则能提高碳源的利用率，也即能提高苹果酸产率。

因此，这是苹果酸发酵值得研究的课题。

6/3苹果酸发酵微生物的分类

一、

黄曲霉

二、

米曲霉

三、

寄生曲霉

四、

华根霉

五、

无根根霉

六、

膜瞨毕赤酵母

七、

短乳杆菌

八、

产氨短杆菌

6/4苹果酸的发酵工艺

L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：

一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。

一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。

两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。

酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。

与化学合成法不同的是，发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型，而化学合成法只能生产DL-苹果酸，如作为食品和药物，则有一半不能得到利用。

6/4.1直接发酵工艺

（一）菌种扩大培养

用于苹果酸直接发酵的黄曲霉和米曲霉都易于产生孢子。

将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下，接到三角瓶中。

瓶中装有种子培养基。

在33C静置培养2~~4天，待长出大量孢子，接到种子罐中。

种子罐装有下述种子培养基（g/L）

葡萄糖（水解糖中）30

豆饼粉10FeSO40.5

K2HPO40.2NaCL0.01

MgSO40.1CaCO360（单独灭菌）

种子罐培养的目的是使孢子发芽，以缩短生产罐的发酵迟滞期。

种子罐的体积是生产罐的10％，装液70％，例如50L罐装液35L。

在100C灭菌20~30min后，冷至40C以下，加入单独灭菌的CaCO接种黄曲霉孢子后在33~34C通气搅拌培养。

通气量

0.15~0.3vvm，罐压维持100KPa加入泡敌（501罐加20ml）抑制泡沫生成。

培养18~20h后接入生产罐。

（二）发酵规程

发酵培养基采用葡萄糖70~80g/l,其余成分与种子培养基相同。

生产培养基除CaCO以外，直接在生产罐内配制，在缓慢搅拌下直接通蒸汽升温至100C，维持20min灭菌。

冷至40C时，加入单独

灭菌（干热160C,2h）的CaCO当品温降到34C时，接种10%种子培养液，通气搅拌进行发酵。

发酵时控制温度33~34C，通气量

0.7vvm,搅拌转速180r/min,泡沫自由控系统流加泡敌控制。

整个发酵过程约需40h。

待残糖降到1g/l以下，放罐进入提取工序。

（三）、影响苹果酸发酵的因素

1.氮源

2.碳酸盐种类

3.碳酸钙用量

4.碳源种类

5.金属离子

6.铁盐

7.抑制剂

8.氨基酸和维生素

9.温度

6/4.2两步发酵工艺

两步发酵是先用根酶将糖类发酵成富马酸（或富马酸与苹果酸混合物），再由酵母或细菌发酵成L-苹果酸的工艺。

这前一步称为富马酸发酵，后一步称为转换发酵。

（一）富马酸发酵

根霉产生富马酸的能力早就被人们所认识。

著名的根霉富马酸发酵菌种有华根霉、无根霉和黑根霉。

根霉在葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面上，于30C培养7天后，易于长出大量孢子。

对于华根霉6508的富马酸发酵，可以采用下述培养基（％）

葡萄糖10（NH4）2SO40.5

K2HPO0.1MgSO4•7HO0.05

FeCI3•6H2O0.002CaCO35

在500ml三角瓶中装液50ml，另外还要加入各种表面活性剂，具体

添加量见后述。

接种华根霉孢子后，先静置培养一段时间，再振荡培养，维持温度30C。

（二）转换发酵

转换发酵是在根霉发酵一定时间后，再加入第二种微生物使富马酸发酵转换成苹果酸发酵。

有这种转换能力的微生物很多。

佐佐木等普查了分别属于假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和球拟酵母属的23株酵母，发现膜璞毕赤酵母的转化率最高。

6/4.3酶法转化工艺酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。

转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸;

而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）。

酶法转化是现在国外生产L-苹果酸的主要方法。

如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体:

Ef

6/4.4固定化细胞转化工艺

前面已经提到，富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。

但实际上遇到的问题是，酶的提纯手续复杂，酶的回收率低，成本高。

（一）产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产

（二）黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产

2.碳源

3.玉米浆

4.通气

5.温度

6.培养时间

6/4.5其他发酵方法

（一）担子菌发酵法

（二）产碱杆菌酶法转化

（三）解脂假丝酵母转化法

（四）解烃富马酸假丝酵母发酵法

（五）假丝酵母酶法转化

（六）栖热菌酶法转化

（七）固定化皱褶假丝酵母转化法

6/5苹果酸的提取和精制

1.苹果酸的提取

发酵液的处理包括前6个步骤，即酸解、过滤、中和、过滤、酸解、过滤。

由于苹果酸发酵中需要添加过量的CaCo3另外形成放的苹果酸钙盐溶解度也极低，所以成熟的发酵酿成浓浆状。

苹果提取工艺流程

二、苹果酸的精制

三、苹果酸结晶工艺流程

6/6苹果酸的检验

6/6.1定性检验

1.三氯化钛法

2.美国药典法

3.纸层析法

6/6.2定量检验

1.酸碱滴定法

2.紫外分光光度法

3.荧光分光光度法

6/7苹果酸的用途

苹果酸广泛存在于各种生物体中，是生物体重要的代谢循环——三羧酸循环的成员之一。

在天然水果（苹果、山楂、葡萄、樱桃）中含量较高，它具有明显的呈味作用，其酸味柔和别致，解渴爽口。

苹果酸广泛用于食品和医药工业中，它的质地稳定，在水中溶解度大。

它在食品等部门中的用途简介如下：

1.食品酸味剂

2.食品加工

3.食品添加剂加工

4.烟草加工

5.医药

6.日用化工

7.化学工业