微生物实验室操作指导Word下载.docx

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2.2.1采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。

2.2.2应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。

2.2.3采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。

2.3采样数量

取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。

样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量一般不少于200g。

根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。

2.4采样方法

2.4.1采取随机抽样的方式。

2.4.2直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。

2.4.3如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至0－4℃。

2.4.4不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。

2.4.5在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。

样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。

2.5样品的保存和运送

2.5.1样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1－5℃环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。

2.5.2冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；

冷却和易腐食品应存放在0－5℃冰箱或冷却库内；

其它食品可放在常温冷暗处。

2.5.3运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。

保证途中样品不升温或不融化。

2.5.4待检样品存放时间一般不应超过36小时。

3检验样品的制备

3.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

3.2检验冷冻样品前应先使其融化。

可在0－4℃融化，时间不超过18小时，也可在温度不超过45℃的环境中融化，时间不超过15分钟。

3.3检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。

如容器已装满，可迅速翻转25次；

如未装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。

从混样到检验间隔时间不应超过3分钟。

3.4开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用75％乙醇消毒开启部位及其周围。

3.5非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基内，吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。

3.6粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基。

3.7固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟。

4检验

4.1实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。

4.2检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。

4.3实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。

4.4制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。

4.5检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。

清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。

5检验记录和结果的报告

5.1经检验的每份样品都应有完整的检验记录。

样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

5.2检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责人审核签字后发出。

1无菌操作要求

微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。

要求如下：

1.1接种细菌时必须穿工作服、带工作帽；

1.2进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用；

1.3接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净；

1.4进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用；

1.5从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边；

1.6接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

1.7接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到针和环与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min,再经火焰烧灼；

1.8吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

2无菌间使用要求

2.1无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

2.2无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品。

2.3无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离工作台1m处，照射时间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。

2.4处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

2.5在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。

3消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

3.1灭菌前准备

3.1.1所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面气孔打开。

3.1.2装培养基的三角瓶塞好棉塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

3.2装放

3.2.1大型高压蒸气锅：

放置灭菌物品不应超过锅内容积的80%，物品应放置锅内搁架上或铁丝筐中。

3.2.2手提式高压锅：

将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

3.3设备检查

3.3.1检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

3.3.2压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。

3.3.3对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

3.4灭菌处理

手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

3.4.1手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需要更换）。

3.4.2手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。

3.4.3盖好顶盖拧紧，勿使漏气；

置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放出冷气（水沸腾后排气10～15min）。

3.4.4关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。

3.4.5达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再打开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾活容器爆破。

3.5灭菌温度与时间

3.5.1压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表：

物品

灭菌时间，min

115℃

121℃

不含糖等耐热培养基

15

含糖类等耐热培养基

15～20

染菌培养物

30

器械器皿

3.6灭菌处理：

灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查，以免再度污染。

3.6.1物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。

3.6.2取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。

3.6.3培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。

3.6.4取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。

3.6.5取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。

3.6.6凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。

3.6.7每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

4有毒有菌污物处理要求

微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。

4.1经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。

4.2经微生物污染的培养物，必须经121℃，30min高压灭菌。

4.3染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小时，再经121℃，30min高压灭菌。

4.4涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗涤。

做凝集试验用的玻片或平皿，必须经高压灭菌后洗涤。

4.5打碎的培养物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。

4.6污染的工作服或进行烈性菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。

5玻璃器皿的清洗要求

5.1目的

为了保证微生物实验顺利进行，保证实验结果的准确性，不影响实验进度，必须把器皿彻底清洗干净。

5.2注意事项

5.2.1任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。

5.2.2一般新的玻璃器皿用2%的盐酸液浸泡数小时，后用水冲洗干净。

5.2.3用过的器皿应立即洗涤，放置太久会增加洗涤困难。

5.2.4强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，以免污染环境水质，必须倒在废水缸中。

5.2.5含有对人体有传染性病菌的器具，应先煮沸灭菌后再进行洗涤。

5.2.6难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。

有油的器皿不要与无油的器皿混在一起，否则使本来无油的器皿沾上了油垢，浪费药剂和时间。

5.3洗涤剂的种类：

水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂

5.4洗涤方法

5.4.1含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法：

事先应将器皿中的琼脂刮去，然后用清水洗涤，并用试管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。

用洗衣粉水洗去油污，然后用自来水冲洗。

洗好后的器皿应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。

5.4.2载玻片及盖玻片的洗涤法：

新载玻片及盖玻片先在20%的盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗2~3次，最后用蒸馏水换洗2~3次。

用过的载玻片及盖玻片，应用纸擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自来水冲洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小时，再用自来水冲洗至中性。

5.4.3移液管、倒管的洗涤方法：

新的移液管及倒管先在的５％盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗几次，最后用蒸馏水换洗几次。

用过的移液管、倒管先用自来水洗去表面的残液，再放在洗衣粉水中浸泡一小时以上，再用自来水冲洗至管内壁无残渣，最后用蒸馏水换洗次，晾干后入恒温干燥箱中烘干。

6培养基、无菌水的制备

6.1基本原理

培养基的种类很多，不同微生物所需要的培养基不同。

培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型。

目前所用培养基均为已配制好的生物试剂和纸片。

6.2器材

三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、角匙、杜氏小管、硅胶塞、电炉

6.3培养基的种类

营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（附加抗菌素）、平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白冻肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、EC肉汤、高盐察氏琼脂、三糖铁琼脂等

6.4方法步骤

6.4.1培养基的制备：

6.4.2称量：

根据培养基的配方，称取适量药品于搪瓷杯中；

6.4.3溶解：

用量筒量取所需水量，置电炉上加热，一边搅拌，至完全溶解，加热至沸腾，拔掉电源，待冷却；

6.4.4分装：

根据不同需要，立即趁热分装入三角瓶或试管中，分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜，分装试管一般为管长的1/5（需根据试管的大小而定）。

液体培养基如乳糖胆盐发酵培养基约分装10毫升左右。

6.4.5塞硅胶塞：

装好培养基的试管应塞上硅胶塞，松紧合适，紧贴管壁，不留缝隙，约1/2塞入内，这样即可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。

6.4.6包装：

三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎，试管集中于试管篓。

6.5无菌水的制备：

6.5.1用10ml移液管量取9.2ml蒸馏水（稀释水）装入试管中。

6.5.2用100ml量筒量取95ml蒸馏水（稀释水）装入150ml的三角瓶中。

可置少许玻璃珠于三角瓶内，防止暴沸。

6.5.3量取240ml蒸馏水（稀释水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮纸包扎好，高压灭菌备用。

7设备使用原则

7.1实验设备的使用由实验员严格按照操作说明书进行，其他人员不得随意操作。

7.2实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行，出现不可排除的故障时，经部门总经理批准，商请专业人员维修。

7.3实验设备应定期进行计量检测，确保仪器的准确性。

7.4实验员应爱护仪器设备，使用前应检查，使用后应及时清理清洁，并定期维护保养，下班前应检查设备电源是否关闭。

1主题内容与适用范围

本文规定了食品平板菌落计数的方法。

本文适用于航空配餐的各种半成品、成品及原料，有专门规定的检验方法的除外。

2设备和材料

超净工作台、恒温培养箱（36±

1℃）、均质器、振荡器、吸管（1ml、10ml）、平皿、稀释瓶、天平等

3培养基和试剂

平板计数琼脂、75％乙醇、磷酸盐缓冲稀释液

4操作程序

4.1样品制备

4.1.1以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。

如有包装，则用75％乙醇在包装开口处擦拭后取样。

4.1.2制备样品匀液

以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：

10的样品匀液。

如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。

4.2稀释样品匀液

4.2.1用10ml灭菌吸管准确吸取1：

10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml稀释瓶中。

迅速振摇，将样品混匀，制成1：

100的样品匀液。

振摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次。

从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。

吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。

4.3平板接种

4.3.1对于每个样品，选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。

4.3.2分别用灭菌吸管吸取1ml样品液放入作了适宜标志的平皿内。

每个稀释度的样品液用两个平皿。

4.3.3分别加12-15ml平板计数琼脂（约45℃左右）到平皿内。

立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。

要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。

同时将平板计数琼脂倾入加有1ml稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。

将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。

4.4培养

待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36±

1℃的恒温培养箱培养48±

2h。

培养箱应保持一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％。

4.5菌落计数和记录

4.5.1培养后，立即计数每个平板上的菌落数。

25-250个菌落为合适范围。

如不能立即计数，应将平板存放于0-4℃，但不得超过24h。

4.5.2操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5％之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10％这内。

否则，应找出原因，加以校正。

4.6计算和记录数字

适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释度倍数计算出每克（毫升）样品中平板菌落数。

记录时，只有在换算到每克（毫升）样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。

也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。

5结果报告

报告每克（毫升）样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。

注：

本文参照SN0168-92《出口食品平板计数》

本文规定了食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。

本文适用于航空食品的检验。

吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±

1℃、44.5±

0.5℃）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜等

月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、EC肉汤、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、MR-PV培养基、Korser氏枸掾酸盐肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液、生理盐水、革兰氏染色液、Kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、Voges-proskauer（V-P）试剂、

4样品制备

4.1以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。

4.2制备样品匀液

4.3稀释样品匀液

用10ml灭菌吸管准确吸取1：

5大肠菌群的测定

5.1大肠菌群MPN值的测定

5.1.1对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。

每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤，每管接种1ml。

5.1.2将接种管置于36±

1℃的培养48±

5.1.3观察试管的产气情况：

检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。

如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；

如有产气者，则进一步作证实试验。

5.2大肠菌群的证实试验

5.2.1将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。

5.2.2置BGLB肉汤管于36±

5.2.3记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

5.2.4结果报告：

按BGLB肉汤产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。

6粪大肠菌群测定

6.1用接种环将所有48±

2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。

6.2将所有接种的EC肉汤管在30min内放入44.5±

0.5℃水浴箱内，培养24±

水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。

应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

6.3记录EC肉汤管的产气情况。

产气管为粪大肠菌群试验阳性；

不产气管为粪大肠菌群试验阴性。

6.4结果报告：

按产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。

7大肠杆菌测定

7.1将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±

1℃的培养24±

7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

7.3如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；

如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。

用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±

1℃的培养18-24h。

7.4将斜面培养物移种到下列培养基进行生化试验。

7.4.1色氨酸肉汤：

在36±

2h后，加Kovacs氏试剂0.2-0.3ml，上层出现红色为靛基质阳性反应。

7.4.2MR-VP培养基：

2h后。

以无菌操作移取培养物1ml至13mm*100mm试管中，加5％α-萘酚乙醇溶液0.6ml，40％氢氧化钾溶液0.2ml和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。

　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。

如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。

7.4.3Korser氏枸掾酸盐肉汤：

于36±

1℃的培养96h记录有无生长。

7.4.4LST肉汤：

2h，观察试管中是否产气。

7.4.5革兰氏染色：

取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。

大肠杆菌为革兰氏阴性。

7.4.6大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下

靛基质

MR

VP

枸掾酸盐

鉴定（型别）

+

-

典型大肠杆菌

非典型大肠杆菌

典型中间型

非典型中间