中药学论文 芦荟通畅胶囊遗传毒性研究Word文件下载.docx
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4.1MLA实验结果8
4.2Ames实验结果9
4.3骨髓微核试验结果10
5讨论11
参考文献13
综述14
致谢19
芦荟通畅胶囊的遗传毒性研究
摘要：
目的评价芦荟通畅胶囊的遗传毒性；
方法采取小鼠淋巴瘤TK基因突变试验（MouseLymphomaassayTKgenemutationtest）、鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（SalmonellaTyphimuriun/Reversemutationassay，AmesAssay）以及骨髓细胞微核试验评价芦荟通畅胶囊的遗传毒性。
设芦荟通畅胶囊提取液剂量组20、10、5、2.5、1.25mg/皿，在添加S9和不添加S9条件下，通过Ames试验和TK试验对其进行体外遗传毒性评价；
设芦荟通畅胶囊混悬液剂量组0.25、0.125、0.0625g/ml，通过骨髓细胞微核试验对其进行遗传毒性评价。
Ames试验中，设置计数TA97a、TA98、TA100、TA102四个标准测试。
菌株在四个浓度下，于37℃、48h培养后回复突变菌落数；
MLA试验中，计算大小集落的孔数、平板效率PE%、基因突变频率MF和小集落百分率SC%；
骨髓细胞微核试验中，每只动物计数1000个嗜多染红细胞，其微核发生率以含微核的PCE千分率计。
结果芦荟通畅胶囊提取物Ames试验受试物各剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照回变菌落数2倍，未出现剂量－反应关系；
MLA试验中，芦荟通畅胶囊提取物各剂量组MF值与溶剂对照组相比均无显著性差异，未出现剂量－反应关系；
骨髓细胞微核试验中受试物各剂量组的微核发生率差异无显著性（P>
0.05），而雌雄小鼠阳性对照组均明显高于阴性对照组（P<
0.01）。
结论芦荟通畅胶囊提取物Ames试验、MLA试验和骨髓细胞微核试验中均未被检测出遗传毒性。
关键词:
芦荟通畅胶囊；
小鼠淋巴瘤TK基因突变实验；
鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验；
骨髓细胞微核试验
GenetictoxicitystudiesofALOERELAXCAPSULE
Abstract:
ObjectiveToevaluatethegenetictoxicityofaloerelaxcapsule;
MethodsadoptMouseLymphomaTKgenemutationtest,Salmonellatyphimurium/backmutationtestandbonemarrowcellsmicronucleustestevaluationofgenetictoxicityofaloerelaxcapsule.Setaloerelaxcapsuleextractdosegroupof20,10,5,2.5,1.25mg/dish,undertheconditionofaddingtheintegratedandnotaddtheintegrated,byAmestestandTKtestontheinvitrogenetictoxicityevaluation;
Putaloerelaxcapsulesuspensionliquiddosagegroup0.25,0.125,0.0625g/ml,throughbonemarrowcellmicronucleustestonthegenetictoxicityassessment.Amestest,setthecountTA97a,TA98,TA100,TA102fourstandardtest.Strainsunderthefourlevels,at37℃,48haftertrainingnumberbackmutationcolonies;
MLAexperiment,calculatingthenumberofholessizecolony,plateefficiencyPE%percentage,genemutationfrequencyMFandsmallcolonySC%;
Micronucleustestofbonemarrowcells,eachanimalcountmorethan1000addictedtodyeredbloodcells,themicronucleusrateinordertocontainthePCEmicronucleusrateofmicrometergauge.ResultsAmestestofaloerelaxcapsuleextractcontentbackintothevariablecolonycounteachdosegroupwerenotmorethanthesolventcomparisonwithcolonycount2times,notyetadoseresponserelationship;
MLAtextsofaloerelaxcapsuleextracteachdosegroupofMFvaluescomparedwithsolventcontrolgrouphadnosignificantdifference,notappeardose-responserelationship;
Bonemarrowcellsmicronucleustestsubjectscontentineachdosegroupofmicronucleusratetherewasnosignificantdifference（P>
0.05）,themaleandfemalemicepositivecontrolgroupweresignificantlyhigherthanthenegativecontrolgroup（P<
0.01）.ConclusionaloerelaxcapsuleextractAmestest,MLAtestandmicronucleustestofbonemarrowcellswasnotdetectedingenetictoxicity.
Keywords:
Aloerelaxcapsule，MouselymphomaTKgenemutationtest，Salmonellatyphimurium/backmutationtest，Bonemarrowcellsmicronucleustes
1前言
中药芦荟被誉为本世纪最有希望的保健食品之一，被用作许多保健品的材料中。
芦荟通畅胶囊中含有芦荟、大豆膳食纤维、西洋参、荷叶等主要成分，其中以芦荟为主要成分。
芦荟（学名：
Aloevera）芦荟属，为百合科多年生常绿草本植物。
芦荟是集食用、药用、美容、观赏于一身植物新星。
芦荟具有预防和治疗各种疾病的功效。
如芦荟素具有高效的健胃整肠的功效,并能提高新陈代谢的速度,使人的皮肤变得美丽。
芦荟肉质部分含有芦荟熊果甙，芦荟熊果甙除了可以预防继父老化外,对胃及十二指肠等溃疡、粘膜溃烂也有明显的治疗成效。
芦荟熊果甙可防止肌肉组织的瘢痕化,使皮肤组织迅速恢复原状。
芦荟中的芦荟酊是抗菌性很强的物质,具有直接杀菌作用。
芦荟中的芦荟咪酊具有抗癌症的作用,能破坏癌变细胞。
芦荟中的芦荟乌鲁辛对溃疡有很好的疗效,能治疗胃及十二指肠溃疡病。
荷叶为睡莲科草本植物莲的叶片。
其药用作用：
荷叶味苦辛微涩、性凉性味寒凉,伤脾胃,归心、肝、脾经。
清香升散；
具有消暑利湿，健脾升阳，散瘀止血的功效。
主治暑热烦渴，头痛眩晕，水肿，食少腹胀，泻痢，白带，脱肛，吐血，衄血，咯血，便血，崩漏，产后恶露不净，损伤瘀血。
[1]
西洋参（学名：
Panaxquinquefolius）是五加科人参属多年生草本植物，其主要作用为增强中枢神经系统功能、保护心血管功能、提高免疫力、促进血液活力、治疗糖尿病、补肺降火、养胃生津的功能。
近年来，中药保健品安全问题日渐突出，中药保健品引起的DNA损伤和染色体畸变突变以及癌变需要得到重视。
芦荟畅通胶囊作为一种常用中药食用保健品，与其遗传毒性相关方面的研究还没见报道。
通常一种遗传毒性检查方法只能检测出少数遗传学终点，并不能检测出所有的遗传学终点，一般要采取多组互补是试验进行遗传毒性评价。
小鼠淋巴瘤TK基因突变试验中小鼠淋巴瘤细胞L5178Y是TK基因突变实验的经典靶细胞，不仅能检测出点突变，对染色体水平及大的缺失等基因突变也能检测出来[4]。
鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（Ames试验）是从原核水平上检测基因突变最常用方法，具有周期短、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种物质的综合效应，是遗传毒性试验的奠基石。
采用Ames试验及MLA试验组合对受试物的遗传毒性进行检测，是一种比较全面的检测方法。
骨髓细胞微核试验受试物采用间隔24h两次经口灌胃法进行骨髓细胞微核试验，验证其体内骨髓细胞微核试验致突变作用。
2材料与仪器
2.1样品
芦荟通畅胶囊，广州市美澳健生物科技有限公司生产，硬胶囊，0.4g每粒，内容物为灰黄色粉末，阴凉干燥处保存。
人体推荐用法为每日口服1次，每次2粒，以体重60kg计，则人体每日最大服用量为13.3mg·
kg-1BW。
2.2主要仪器与试剂
电子天平（UX4200H型、BP210D型、BS2202S、BT125D型、BS2202S型）；
细胞计数仪（SingaporeBIO-RADLaboratories,inc,型号TC10）；
LeicaDMLS型偏光显微镜；
低速离心机；
液氮罐；
洁净工作台；
恒温培养箱；
恒温水浴锅；
蒸汽压力锅；
经鉴定生物学特性符合要求的L5178Ytk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞，来源：
武汉大学；
经鉴定生物学特性符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100和TA102四株试验菌株，来源：
甲醇；
二甲基亚砜（DMSO）；
Na2HPO4·
12H2O；
NaH2PO4·
2H2O35.6g；
氯化钾溶液（1.65mol·
L-1）；
氯化镁溶液（0.4mol·
葡萄糖-6-磷酸钠溶液（0.05mol·
辅酶-II溶液（0.025mol·
肝S-9液；
Giemsa染液；
磷酸二氢钾；
磷酸二氢钠马血清（批号：
8178916，Gibco），InvitrogenCorporation公司产品）；
辅酶-II（批号:
38277，SIGMA公司生产）；
葡萄糖-6-磷酸钠盐（批号:
75720，SIGMA公司生产）；
三氟胸苷（TFT）（批号：
28256，SIGMA公司生产）。
2.3实验动物
SPF级NIH小鼠，50只，雌雄各半，体重25g~30g，动物和饲料均由广东省医学实验动物中心提供。
3方法
3.1样品制备
3.1.1MLA实验样品制备
根据受试物毒性测试结果，称取内容物2.0g，高压灭菌后用二甲基亚砜（DMSO）溶解定容至10mL，制成200mg·
mL-1溶液供试验用。
3.1.2Ames实验样品制备
根据受试物毒性测试结果，称取内容物2.0g，高压灭菌后用二甲基亚砜（DMSO）溶解定容至10ml，制成200mg·
3.1.3骨髓微核试验样品制备
试验时取胶囊内容物，加灭菌水分别制成0.25、0.125、0.0625g·
mL-1浓度的混悬液，作为高、中、低剂量组的受试物溶液。
3.2剂量选择与受试物给予方式
3.2.1MLA实验剂量选择
将200mg·
mL-1受试物溶液用DMSO倍比稀释，得20、10、5、2.5mg每个皿共4个剂量，同时设阴性对照、溶剂对照（DMSO）和阳性对照。
3.2.2Ames实验剂量选择
mL-1受试物溶液用DMSO倍比稀释，得20、10、5、2.5、1.25mg/皿共5个剂量，同时设未处理对照、溶剂对照（DMSO）和阳性对照。
3.2.3骨髓微核试验剂量选择与受试物给予方式
设阴性对照组、阳性对照组以及低、中、高三个受试物剂量组。
受试物组剂量分别为2.5、5.0、10.0g·
kg-1BW，各相当于人体推荐最大剂量的188、376、752倍。
阴性对照为灭菌水，阳性对照为40mg/kgBW剂量的环磷酰胺。
采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验。
3.3小鼠淋巴瘤TK基因突变实验（MLA试验）
实验原理：
TK基因突变试验的检测终点是胸苷激酶（thymidinekinase,TK）基因的突变。
TK基因在小鼠定位于11号染色体。
故TK基因突变属于常染色体基因突变。
TK基因产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷（TdR）生成胸腺苷（TMP）反应。
正常情况，由于体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP）即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成的TMP,所以TdR生成TMP的反应非生命必需。
但如果在细胞培养基中加入胸苷类似物如三氟胸苷（TFT-trifluorothymidine），则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而参入DNA，造成死性突变，则细胞无法存活。
若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷，则TFT不能磷酸化也无法掺入DNA，则细胞能够生长，表达出TFT抗性。
根据突变集落形成数，计算突变率，判定芦荟畅通胶囊的致突变性。
3.3.1培养液和培养条件
含20%马血清和适量抗菌素的RPMI1640培养液，5%CO2,37℃、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。
3.3.2细胞复苏
将冻存的小鼠淋巴瘤细胞从液氮罐中取出，立即放入37℃的水浴锅钟解冻，在5min内用含有20%的马血清和1%双抗的RPMI1640培养基将小鼠淋巴瘤细胞稀释到十倍体积，放入CO2培养箱中培养。
3.3.3接触处理
取生长良好的细胞，调整细胞浓度为1×
106个/mL。
取10mL细胞悬液与8.8mlRPMI1640培养基、0.2mL受试液（各样品组加入相应浓度的供试样品稀释液；
溶剂对照组加入DMSO，阴性对照组加入双蒸水；
阳性对照组加入阳性对照品溶液）以及1mL150mmol/L氯化钾溶液或1mlS9混合液（当需要代谢活化时）混合。
将上述各种混合液置于50mL带盖离心管中37℃振荡培养4h，振荡频率为80r/min。
3.3.4表达
将上述各种混合液以125g离心5min，去除上清液，用无血清RPMI1640培养基洗涤细胞两次。
重新悬浮于RPMI1640培养基中，调整细胞密度为3×
105个每毫升，37℃培养2d。
于24h检查细胞密度并调整为3×
105个毫升。
3.3.5平板制备
3.3.5.1PE0（0天的平板接种效率）平板：
取接触处理后的细胞悬液，梯度稀释至细胞数量为8个每毫升，接种于96孔板，每孔加0.2mL（即每孔平均细胞接种数为1.6个）。
每个剂量接种一块平板。
3.3.5.2PE2（第二天的平板接种效率）平板：
第二天表达培养结束后，取适量细胞悬液，梯度稀释至细胞数量为8个每毫升，接种于96孔板，每孔加0.2mL（即每孔平均细胞接种数为1.6个）。
3.3.5.3TFT拮抗平板：
第二天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×
104个每毫升，加入TFT（三氟胸苷，终浓度为3µ
g·
mL-1），混匀，接种96孔板，每孔加0.2mL（即每孔平均细胞接种数为2000个），各组接种两块平板。
所有平板均置于CO2培养箱中37℃培养12-20d。
3.3.6集落计数
目视观察计数各平板无集落生长的孔数。
突变集落按大集落（LC：
直径≥1/4孔径，密度低）和小集落（SC：
直径＜1/4孔径，密度高）分别计数。
3.3.7数据处理
3.3.7.1平板效率（PE0和PE2）
PE=
-ln（EW/TW）
N
式中：
PE------平板效率，PE0或PE2；
EW-----无集落生长的孔数；
TW-----平板总孔数；
N-----每孔接种细胞数,1.6。
3.3.7.2相对存活率
RS=
PEa
×
100%
PEb
RS-------相对存活率（%）；
PEa-----样品组平板效率；
PEb-----阴性对照组平板效率。
3.3.7.3TFT抗性突变频率（MF）
MF×
10-6=
-ln（EW/TW）/n
PE2
MF-------TFT抗性突变频率；
EW-------无集落生长的孔数；
TW-------平板总孔数；
n-------每孔接种细胞数，2000；
PE2------PE2平板效率
3.4鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（Ames试验）
实验原理鼠伤寒沙门氏菌突变型即组氨酸缺陷型菌株在无组氨酸的培养基上无法生长，在有组氨酸的培养基上可以正常的生长。
但是在无组氨酸的培养基上有致突变物存在的时候，沙门氏菌突变型（组氨酸缺陷型）菌株可突变为野生型即表达型。
因此鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株在无组氨酸培养基上也能生长，根据菌落的形成数，可以检测出芦荟畅通胶囊内容物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化系统活化后方可使沙门氏菌突变型发生回复突变，代谢活化系统通常用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆（S-9）制备的S-9混合液。
3.4.1主要溶液与培养基配置
磷酸盐缓冲液配置：
配制时，常先配制0.2mol·
L-1的NaH2PO4和0.2mol·
L-1的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol·
L-1的磷酸盐缓冲液（PB）。
（1）0.2mol·
L-1的Na2HPO4配置：
称取Na2HPO4·
12H2O31.2g，加二次水至1000ml溶解。
（2）0.2mol·
L-1的NaH2PO4配置：
称取NaH2PO4·
2H2O35.6g，加二次水至1000ml溶解。
（3）0.2mol·
L-1pH7.4的磷酸盐缓冲液的配制：
取19ml0.2mol·
L-1的NaH2PO4和81ml0.2mol·
L-1的Na2HPO4，充分混合即为0.2mol·
L-1的磷酸盐缓冲液（pH约为7.4-7.5）。
若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
10%S-9混合液配置临时用临时配置，10%S-9混合液每10mL混合：
磷酸盐缓冲液（0.2mol·
L-1，pH7.4）6mL；
L-1）0.2mL；
L-1）1.0mL；
L-1）1.6mL；
肝S-9液1.0mL。
混匀，置冰浴中待用。
3.4.2菌株的培养
取肉汤培养基6ml于无菌小细菌培养瓶中，将经鉴定生物学特性符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四株试验菌株接种到小细菌培养瓶中中，每瓶15μL。
37℃振荡培养（100次/min）10个小时至对数增长期。
培养瓶用黑纸包裹，以防光线照射细菌。
3.4.3加样铺板
剂量组的设置为200mg/ml受试物溶液用DMSO倍比稀释，得每皿20、10、5、2.5、1.25mg共5个剂量，同时设未处理对照、溶剂对照（DMSO）和阳性对照。
正式采用平板掺入法。
在顶层琼脂中加入0.1ml试验菌株增菌液、0.1ml受试物溶液和0.5mlS-9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上。
37℃培养48h，计数每皿回变菌落数。
如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数2倍以上，并具有剂量反应关系者则定为阳性。
整个试验在相同条件下重复做一次。
3.5骨髓微核试验
3.5.1实验动物处理
经口灌胃。
采用30h给受试物法。
即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。
3.5.2标本制备
取胸骨或股骨，用止血钳挤出骨髓液与拨片一端的小牛血清混匀，常规涂布，或用小牛血清冲洗股骨骨髓制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定5~10min。
当日固定后保存，将固定好的涂布放入Giemsa应用液中，染色10~15min。
立即用pH6.8的磷酸盐或蒸馏水冲洗、晾干，写好标签，阴凉干燥处保存。
3.5.3计算比例
每只动物计数1000个嗜多染红细胞，其微核发生率以含微核的PCE千分率计，使用SPSS软件进行X2检验。
受试物组与阴性对照组相比，微核发生率统计学上差异有显著性并且有明显的剂量反应关系者，即可确定为阳性。
若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。
4结果
4.1MLA实验结果
由表1和表2可见，除阳性对照外各剂量组PE0和PE2在正常范围（PE0=60～140%，PE2=70～130%，MF<
240×
10-6），受试物各剂量组MF值与溶剂对照组相比均无显著性差异，亦无剂量－反应关系，故对L5178Ytk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞，在加与不加S9时，均未见受试物有致突变作用。
表1无活化系统组细胞突变频率
剂量组
PE0（%）
PE2（%）
RS0（%）
RS2（%）
MF（×
10-6）
阴性对照
84
116
/
68
溶剂对照
79
112
94
97
60
样品100%
108
100
93
79
样品50%
101
120
104
73
样品25%
87
125
103
61
阳性对照
6
69
7
59
461**
表2有活化系统组细胞突变频率
82
141
71
130
49
85
78
77
89
109
升级会员 