食品酶学实验菠萝蛋白酶重点讲义资料Word格式.docx
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200mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×
1，100mL×
2，200mL×
1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×
1，1mL×
2，0.1mL×
1，0.2mL×
1）、漏斗（3个）、量筒（100mL×
1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。
（2）全班共用的用品
试剂瓶（1000mL×
7，250mL×
3，60mL×
20）、烧杯（1000mL×
4）、塑料烧杯（2000mL×
2）、量筒（500mL×
2，1000mL×
2）、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量8000~14000）。
【实验材料及试剂】
1.实验材料
新鲜菠萝（3个）。
2.试剂配制
（1）盐析粗提液
①0.1mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL）：
称取65.166gNa2HPO4·
2H2O（或131.108gNa2HPO4·
12H2O）5.305gNaH2PO4·
2H2O，加蒸馏水溶解，定容至4000mL。
②0.01mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL）：
称取6.517gNa2HPO4·
2H2O（或13.111gNa2HPO4·
12H2O）0.531gNaH2PO4·
（2）酶活力测定试剂
①1％酪蛋白（进口分装）（配100mL）:
称1g酪蛋白，溶于100ml0.1mol/LPBS（PH7.8），于40-50oC水浴溶解，不停搅拌，约需1-2h才能完全溶解。
②激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/LEDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠）]：
用0.1mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制，配制100mL，现配现用。
③10％三氯乙酸（TCA）：
称20g三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至200mL。
（3）透析袋的处理
新买的透析袋，裁剪成所需大小，在蒸馏水中煮沸30min，取出用蒸馏水漂洗干净，即可使用。
【实验步骤】
1.菠萝蛋白酶的粗酶提取
称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/LpH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°
C3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2.盐析
根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°
C4000rpm离心10min，收集沉淀，加入0.1mo1/LpH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
3.透析
将溶解液装入2.5cm×
8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：
取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。
若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。
4．酶活力测定方法
取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。
取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。
离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。
酶活单位定义：
在上述条件下，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。
实验步骤按照表格中完成。
试剂（ml）
对照组
平行样品1
平行样品2
平行样品3
TCA
3
—
酶液
0.1
激活剂
0.9
酪蛋白
1
37°
C准确反应10min
A280nmOD值
5.蛋白质含量测定方法
将酶液稀释至一定程度，采用考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量（参照附录1）。
【结果计算】
1.蛋白质含量计算参照附录1。
2.酶活力计算
最后酶活结果取3次重复实验的平均值。
A280nm
0.001×
酶液活力（U/mL）=×
稀释倍数
3.酶比活的计算
酶比活（U/mg·
蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量
4.酶纯化过程中回收率计算
回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×
100
=〔（纯化酶活力×
纯化酶液体积）/（粗酶活力×
粗酶体积）〕×
5.酶纯化倍数的计算
纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力
6.分析及讨论
将测定的数据整理计算分别填入下表，并菠萝蛋白酶的分离纯化效果进行分析和讨论。
菠萝蛋白酶分离纯化表
步骤
总体积（mL）
总蛋白质含量（mg）
总活力（U）
比活力（U/mg·
蛋白）
回收率（%）
纯化倍数
粗提取
盐析
透析
【注意事项】
1.酶活性测定时的反应时间一定要准确，并严格控制好反应时的温度。
2.高速离心前一定要平衡好离心管。
3.注意透析袋是否破裂，透析时间长时要置于4℃下进行。
【思考题】
1.如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活。
2.常见的酶活性表示方法有那些（如：
U/mL酶液；
U/mg蛋白质;
U/g干重或鲜重；
U/g酶粉等）？
它们各有什么含义，适用哪些场合？
3.蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？
哪些变性了？
哪些没有变性？
4.实验中硫酸铵盐析为什么要选择0%~30%饱和度？
【参考书目】
1.李建武，萧能，余瑞元等，生物化学实验原理和方法，北京，北京大学出版社，1994
2.余冰宾．生物化学实验指导．北京：
清华大学出版社，2003
3.赵亚华，高向阳．生物化学与分子生物学实验技术教程．北京：
高等教育出版社，2005
附录1
实验考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质含量
掌握考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理和方法。
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内（0～1000μg/mL），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质和考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量。
大量的去污剂对测定有严重的干扰，少量可通过对照消除。
由于此法简便迅速、干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。
【实验器材】
分光光度计、离心机、分析天平（万分之一）、药物天平、研钵、烧杯、量筒（10mL×
1）、容量瓶（100mL×
1）、刻度吸管（lmL×
1，0.lmL×
1）、具塞刻度试管（10mL×
1）、漏斗、漏斗架、剪刀。
（1）样品溶液。
（2）标准溶液：
准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg/mL的原液。
（3）染液：
称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50mL90％乙醇溶液中，再加入100mL85％的磷酸，最后用蒸馏水定容至1000mL。
此溶液在室温下可放置一个月。
1.标准曲线的绘制
（1）0~1000μg/mL标准曲线的绘制：
另取6支试管编号，按下表加入试剂。
管号
2
456
1000μg/mL牛血清白蛋白（mL）
蒸馏水（mL）
蛋白质浓度（μg/mL）
1.0
0.2
0.8
200
0.4
0.6
400
0.60.81.0
0.40.20
6008001000
得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000μg/mL标准曲线。
2.样品的测定
准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤
（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。
由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×
定容体积（mL）
样品蛋白含量（μg／g鲜重）＝─────────────────—————
样品重量（g）
1.比色应在出现蓝色2min～1h内完成。
2.测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇浸泡将比色杯上的蓝色清洗干净。
1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？
2.比较双缩脲法、Folin-酚法、紫外吸收法、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的优缺点。
【参考书目】
1.Bradford，M.M.，Anal.biochem：
1976，248-254
2.李建武，萧能，余瑞元等.生物化学实验原理和方法.北京：
北京大学出版社，1994
附录2硫酸铵饱和度计算表
（1）调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25C）
硫酸铵终浓度，%饱和度
10
20
25
30
33
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
90
硫酸铵初浓度，饱和度
每1L溶液加固体硫酸铵的g数
56
114
176
196
209
243
277
313
351
390
430
472
516
561
662
767
57
86
118
137
150
183
216
251
288
326
365
406
449
494
592
694
29
59
78
91
123
155
189
225
262
300
340
382
424
520
619
49
61
93
125
158
193
230
267
307
348
485
583
19
62
94
127
162
198
235
273
314
356
546
12
43
74
107
142
177
214
252
292
333
426
522
31
63
129
164
238
278
319
411
506
97
132
168
205
245
285
375
469
32
99
134
171
210
250
339
431
66
101
302
392
67
103
141
179
264
353
34
69
105
143
227
190
275
72
153
237
36
115
77
157
79
*在25C下，硫酸氨溶液由粗浓度调到终浓度时，每L溶液所加固体硫酸铵的g数
（2）调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0C）
在0C硫酸铵终浓度，%饱和度
85
95
硫酸铵初浓度，%饱和度
每100mL溶液加固体硫酸铵的g数*
10.6
13.4
16.4
19.4
22.6
25.8
29.1
32.6
36.1
39.8
43.6
47.6
51.6
55.9
60.3
65.0
69.7
5
7.9
10.8
13.7
16.6
19.7
22.9
26.2
29.6
33.1
36.8
40.5
44.4
48.4
52.6
57.0
61.5
66.2
5.3
8.1
10.9
13.9
16.9
20.0
23.3
26.6
30.1
33.7
37.4
41.2
45.2
49.3
53.6
58.1
62.7
15
2.6
5.4
8.2
11.1
14.1
17.2
20.4
23.7
27.1
30.6
34.3
38.1
42.0
46.0
50.3
54.7
59.2
2.7
5.5
8.3
11.3
14.3
17.5
20.7
24.1
27.6
31.2
34.9
38.7
42.7
46.9
51.2
55.7
5.6
8.4
11.5
14.6
17.9
21.1
24.5
28.0
31.7
35.5
39.5
47.8
52.2
2.8
8.6
11.7
14.8
18.1
21.4
24.9
28.5
32.3
36.2
40.2
44.5
48.8
5.7
8.7
11.8
15.1
18.4
21.8
25.4
32.9
36.9
41.0
45.3
2.9
5.8
8.9
12.0
15.3
18.7
22.2
33.5
37.6
41.8
5.9
9.0
12.3
15.6
19.0
26.3
30.2
34.2
38.3
3.0
6.0
9.2
12.5
15.9
23.0
26.8
30.8
34.8
6.1
9.3
12.7
16.1
23.5
27.3
31.3
3.1
6.2
9.5
12.9
20.1
23.1
27.9
6.3
9.7
13.2
16.8
20.5
24.4
3.2
6.5
9.9
17.1
20.9
6.6
10.1
17.4
3.3
6.7
10.3
3.4
6.8
10.5
7.0
3.5
*在0℃下，硫酸铵溶液由初浓度到终浓度时，每100mL溶液所加固体硫酸铵的g数。
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