第5章 分子杂交技术Word文档下载推荐.docx

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HCl（pH8.0）0.2mL、5mol/LNaCl1.2mL、0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.04mL、0.1mol/L二硫苏糖醇2mL、ddH2O2.21mL，总体积为20mL。

无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。

临用前加入50mg/mL变性鲑鱼精DNA75µ

gl/mL。

7．20×

SSC：

NaCl175.3g

柠檬酸钠88.2g，

用NaOH调pH至7.0加水到1000mL。

高压灭菌。

8．抗体稀释液：

TritonX-10080µ

L、BSA0.2g，以0.05mol/LPBS定溶至20mL。

9．TSM1：

1mol/LTris·

Cl（pH8.0）10mL

5mol/LNaCl2mL

1mol/LMgCl21mL

加ddH2O100mL

10．TSM2（新鲜配制）：

1mol/LTris·

HCl（pH9.5）10mL

5mol/LNaCl2mL

加ddH2O100mL。

11．显色液（临用前现配）：

5mLTSM2加显色液原液（NBT/BCIP）150µ

L，并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24µ

g/mL，避光。

12．探针：

地高辛标记NGF的cDNA探针。

13．抗体：

抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物。

14．显色液原液：

NBT/BCIP

15．1µ

g/mL蛋白酶K

16．3%戊巴比妥钠

17．0.25%乙酸酐/100mmol/L三乙醇

四、仪器设备及耗材

冰冻切片机，移液器，Eppendorf管，PE手套，载玻片，盖玻片，烘箱，培养箱，水浴锅，温度计，卧式染缸，试剂瓶，离心机，Tip头，锡箔纸，滤纸，冰箱，移液器架，离心管架，Tip头架，高压灭菌锅，荧光显微镜。

五、实验方法

1．取材、冰冻切片

将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。

取材（本实验直接取脑组织），置于4%多聚甲醛中后固定4h。

以100mmol/LPBS浸泡冲洗4～5次（换液：

1次/h）。

将组织块入30%蔗糖/100mmol/LPBS液（4℃），1～2d后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15µ

m。

2．原位杂交反应

（1）切片于100mmol/LPBS（pH7.2）浸5～10min；

（2）0.1mol/L甘氨酸/100mmol/LPBS浸5min；

（3）0.3%TritonX-100/100mmol/LPBS浸10～15min；

（4）100mmol/LPBS洗5min×

3次，加蛋白酶K（1µ

g/mL），37℃孵育30min；

（5）4%多聚甲醛浸5min；

（6）100mmol/LPBS洗5min×

2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/100mmol/L三乙醇胺中10min；

（7）预杂交：

滴加适量预杂交液，42℃30min；

（8）杂交：

倾去预杂交液，在每张切片上滴加10～20µ

L探针与杂交液混合物（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5ng/µ

L），覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。

（9）4×

SSC、2×

SSC、1×

SSC、0.5×

SSC37℃各洗20min；

0.2×

SSC37℃洗10min；

SSC与100mmol/LPBS各半洗10min；

0.05mol/LPBS洗5min×

2次。

（10）3%BSA/0.05mol/LPBS包被，37℃30min。

（11）滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:

5000稀释）4℃孵育过夜。

（12）0.05mol/LPBS洗15min×

4次；

TSM110min×

2次；

新鲜配制TSM210min×

（13）显色：

在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。

（14）显微镜下观察结果。

六、作业与思考题

1．在整个实验过程中，一定要防止污染，所有实验用玻璃器皿及镊子都应灭菌、最好戴口罩和消毒手套，为什么？

2．甲醛固定有什么作用？

实验二细菌菌落的原位杂交

一、原理及用途

用转化细菌涂布琼脂平板，经数小时培养使菌落生长至适当大小后，将菌落转移到杂交膜上，用碱溶解等方法溶解细菌并使释放的DNA变性，用烘烤或紫外线照射等方法将变性的DNA固定在杂交膜上，然后进行核酸杂交和信号显示。

通过将杂交信号与原琼脂平板进行对位，便可找出与杂交信号对应的阳性菌落。

细菌菌落的原位杂交是筛选重组菌克隆的常用方法之一，也是筛选cDNA文库的常用方法，目前仍广泛使用。

由于试验目的不同，涂布琼脂平板的细菌数以及随后的操作可能有所差异，但基本原理和操作过程大同小异。

本实验以中等数量菌落的原位杂交为例，练习菌落原位杂交的基本操作。

重组质粒转化的大肠杆菌培养物。

1．含适当抗菌素（如氨苄青霉素）的LB琼脂平板

2．印度墨汁

3．DNA变性溶液：

1.5mol/LNaCl

0.5mol/LNaOH

4．中和溶液：

0.5mol/LTris（pH7.4）

5．10%SDS

6．2×

SSC或SSPE

7．预杂交/杂交液：

见附录

5×

SSC

Denhardt溶液

1%（W/V）SDS

使用前补加100ug/mL变性的鲑鱼精DNA）标记探针

8．封闭液：

10mmol/LTris-Cl

150mmol/LNaCl

0.05%（V/V）Tween-20

9．6×

SSC或SSPE预洗液：

10．2×

SSC/0.1%SDS

11．1×

SSC/0.1%SDS

12．0.1×

杂交炉或水浴摇床，真空烘烤炉或紫外交联仪，水浴箱，杂交用尼龙膜，专用塑料袋或杂交玻璃管，Whatman3MM环形滤纸，玻璃或塑料盘等。

1．用软质铅笔将90mm直径的杂交膜编号，然后用平头镊将其放在盛有蒸馏水的玻璃容器中，待其湿润后，夹在两张滤纸的中间，再用锡箔纸包装，高压灭菌（1.05kg/cm2，10min）后备用。

2．用重组质粒转化的大肠杆菌涂布90mm直径的LB琼脂平板（含特定抗菌素，制备后2~3d内的琼脂平板效果最佳），细菌培养物的稀释倍数及用量以产生2000~2500个菌落为宜（通过预试验确定）。

将琼脂平板在37℃培养箱内培养，使菌落生长至平均大小为1.5mm左右。

此琼脂平板用塑料薄膜包裹，暂存于4℃备用。

3．在无菌环境下打开长有菌落的琼脂平板，用两个消毒镊子（左右手各一）夹取消毒后的杂交膜，使其对准琼脂平板，并小心地与琼脂表面的菌落接触，直到杂交膜完全湿润为止（见图5-1）。

此操作的关键之一是尽量避免在琼脂与杂交膜之间形成气泡，具体做法是使杂交膜微微曲折，从中间开始逐渐与琼脂表面接触。

4．在杂交膜湿润过程中，用蘸有墨汁的大号针头穿透杂交膜和琼脂培养基，从而产生3个不对称的孔洞，作为杂交信号与菌落对位的标记。

5．用平头镊夹取杂交膜的一边，并轻轻且平稳地将其从琼脂培养基表面揭下，并立即转移到另一琼脂平板内（菌落面朝上），连同原琼脂平板（简称母板）一起在37℃培养箱内培养5~7h，使菌落生长至2~3mm。

6．培养后的母板用塑料薄膜包裹，反转放置于4℃冰箱内备用。

用平头镊将杂交膜从琼脂平板中取出，在10%SDS浸透的滤纸上放置3min，以防止变性和中和过程中质粒DNA的扩散。

7．将90mm直径的Whatman3MM或同等滤纸置于3个清洁的玻璃盘内，每盘3张，分别向盘内加入DNA变性液、中和液和2×

SSC，将多余的液体倒出，并用玻璃吸管赶去滤纸与容器间的气泡。

8．用镊子夹取上述（操作步骤6）杂交膜，依次平放于变性液、中和液和2×

SSC饱和的滤纸上，每次放置时间各为5min。

在杂交膜向下一盘滤纸转移前，应使其与盘的边缘接触，然后使其一角与吸水纸接触，以便吸去多余的液体。

9．DNA与杂交膜固定结合的方法有烘烤法和紫外交联法。

前者是较为经典的方法，虽然需时较长，但效果可靠。

具体做法是将上述杂交膜在滤纸上室温干燥至少30min，然后夹在两张滤纸的中间，在80℃真空干燥炉内烘烤1~2h。

注意不要烘烤过度，以免杂交膜损坏和出现非特异杂交信号；

紫外交联法是将上述杂交膜在2×

SSC内浸透，或直接置于干燥滤纸上（根据产品说明），在354nm波长的紫外线下照射3~5min。

为便于杂交信号与相应克隆的准确对位，也避免因杂交背景过低而无法显示针头打孔的位置，常在高温烘烤或紫外交联前，以针头打孔为顶点将杂交膜剪出3个不对称的三角形缺口，并在母板上画出同样的缺口标记。

10．将上述尼龙膜漂浮在一盘6×

SSC的液面，待其由下而上完全湿润后，浸入液体内泡2min以上。

11．预杂交/杂交可在专用杂交转管及杂交炉中进行，也可在塑料袋及水浴摇床中进行。

本实验练习在塑料袋的杂交方法，具体做法是：

将尼龙膜装入略大的塑料袋中，向袋中加入预热的预杂交液（约0.2mL/cm2），尽量挤出袋中的气泡，然后用加热封口机封口，在68℃水浴摇床内孵育1~2h。

图5-1菌落从琼脂平板向杂交膜转移示意图。

12．将双链标记探针在100℃加热5min使其变性（单链探针不需变性），然后冰浴冷却2min。

将塑料袋取出，剪去一角，并加入变性探针后再次封口，注意挤去气泡。

13．将塑料袋重新放回68℃水浴摇床中，继续杂交过夜。

14．杂交结束后取出塑料袋，剪去其一角，将杂交液倒在专用容器内，剪开塑料袋并取出杂交膜，将膜在装有数百毫升0.5%SDS/2×

SSC的塑料盒中室温下浸泡5min，再在0.1%SDS/2×

SSC中浸泡15min。

15．倒出盒中液体，向其中加入预热至68℃的0.5%SDS/0.1×

SSC，并在同样温度的摇床中洗涤30~60min。

在此过程中，可用手提式放射性探测仪测定膜上的放射活性，并根据情况决定洗涤时间。

16．将杂交膜在室温的0.1×

SSC中过洗，然后置于吸水纸上吸去多余液体（不必晾干，以备在需要的情况下再次洗涤）。

17．用塑料薄膜包裹杂交膜，适当标记后在暗房内放入装有X-光胶片的暗盒，然后将暗盒置于黑色塑料袋中，在-70℃冰箱内暴光10~24h。

18．在暗房内取出胶片，用常规方法显影和定影，并用吹风或室温下晾干。

19．将一张透明塑料纸贴在显影后的X-光胶片上，用记号笔标出3个不对称缺口和阳性信号的位置，然后与保存的母板对位，找出相应的阳性克隆（菌落）。

20．用消毒牙签挑取可疑的阳性克隆，以便进行细菌培养、质粒DNA制备和其它试验。

菌落原位杂交筛选阳性克隆的准确性受多种因素影响，包括菌落的密度、母板及杂交膜的位置标记是否正确、杂交背景及非特异信号的强弱和个人实践经验等，必要时需进行两轮或多轮杂交，才能明确鉴定出真正的阳性克隆。

一旦获得阳性克隆，应及时进行菌种的培养和保存。

1．反复进行菌落从琼脂平板向杂交膜转移的实验操作。

2．影响菌落原位杂交筛选阳性克隆准确性的因素有哪些？

实验三基因定位的染色体原位杂交

荧光原位杂交（FISH）技术最早出现于1969年，起初是对爪蟾卵母细胞中的核糖体序列作图，后来，用于对果蝇多线染色体上的重复序列作图。

以后，随着各种技术的改进，发展到用于对动、植物染色体上的单拷贝基因的作图。

荧光原位杂交（FISH）技术使用荧光标记与检测系统代替了放射性标记与检测。

探针标记物多采用生物素或地高辛等半抗原，而以分别与它们具有特异性高度亲合力的抗生物素和抗地高辛抗体为检测配体，在配体上分别连接不同的荧光物质，如异硫氰酸荧光素（FITC）或德克萨斯红（texasred）等。

探针经过变性为单链DNA，与已变性的染色体DNA进行杂交，探针与靶DNA结合成双链，再用检测配体与探针上的生物素或地高辛结合，由于配体上连接荧光物质，在不同的激发光下，荧光物质发出不同荧光，背景染色用PI、DAPI等荧光染料染色，在荧光显微镜下，可观察到探针所在位置，就是目标DNA。

检测配体可以再接检测配体，进行信号二次放大，增加检测灵敏度。

荧光原位杂交是细胞遗传学与分子遗传学之间的桥梁，广泛应用于分子生物学和遗传学领域。

常规染色体标本制片。

1．70%甲酰胺/2×

35mL甲酰胺

5mL20×

10mLddH2O

2．50%甲酰胺/2×

100mL甲酰胺

20mL20×

80mLddH2O

3．洗脱液：

100mL20×

加Tween20500mL

加水至500mL。

4．BlockingI：

3%BSA

4×

0.1%Tween-20

5．BlockingII：

5%goatserum

0.1%Tween20

6．20×

NaCl175.3g

柠檬酸钠88.2g

用NaOH调pH至7.0

加水到1000mL，高压灭菌。

7．杂交液：

40mL25%硫酸葡聚糖（DS）

20mL20×

40mLddH2O

取上述混合物50mL，与5mL去离子甲酰胺（DF）混合。

8．探针：

生物素标记小鼠Y染色体的长臂探针

9．Rubbercement粘合剂：

移液器，EP管，一次性手套，塑料膜，烘箱，培养箱，水浴锅，温度计，立式染缸，试剂瓶，离心机（冷冻和常规），Tip头，锡箔纸，滤纸，冰箱，培养皿，移液器架，离心管架，Tip头架，高压灭菌锅，荧光显微镜。

1．常规染色体标本制片（注意：

制片时固定时间加长，最后一次固定采用甲醇：

冰醋酸=1：

1的固定液）；

2．染色体标本预处理

（1）染色体本于50℃烤片至少2h。

（2）标本置70～75℃，70%甲酰胺/2×

SSC中变性2～3min。

（3）立即按顺序将标本经-20℃的系列冰乙醇70%，90%，100%中脱水各5min。

（4）室温干燥，凉干。

3．原位杂交

（1）探针变性：

2mL探针加8mL杂交液，于75℃水浴变性5min，立即置0℃，5～10min。

（2）将已变性的DNA探针滴在已变性并脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，Rubbercement封片，置于潮湿暗盒中，37℃杂交过夜（约15～17h）。

4．洗脱、荧光检测与信号放大

（1）将标本从37℃温箱中取出，去掉封片胶和盖玻片，于42℃～50℃的50%甲酰胺/2×

SSC中洗涤4次，每次5min。

（2）于42～50℃的1×

SSC中洗涤3次，每次5min。

（3）玻片在室温下，于2×

SSC中轻洗一下。

（注意：

每一步在转入下一步之时，都应用吸水纸吸一下玻片底边的液体）

（4）加100mL封闭液I于标本上，盖上塑料膜，37℃温育20min。

（5）加100mLavidin-FITC于标本上，盖上塑料膜，37℃继续温育40min。

（6）取出标本，于42℃～45℃，4×

SSC/0。

1%Tween20中洗涤3次，每次5min。

（7）加BlockingII于标本上，盖上塑料膜，37℃温育20min。

（8）加100mLantiavidin于标本上，37℃温育30～60min。

（9）取出标本，于42～45℃，4×

SSC/0.1%Tween20中洗涤3次，每次5min。

（10）加100mLBlockingI于标本上，盖膜，37℃温育20min。

（11）加100mLavidin-FITC于标本上，盖膜，37℃温育40min。

（12）取出标本，42～45℃，4×

SSC/0.1%Tween20中洗涤3次，每次5min；

再于2×

SSC中室温轻洗一下。

（13）玻片于洗涤液中取出，自然干燥，加PI/antifade10uL复染，盖上盖玻片。

5．观察：

在荧光显微镜下，选择适合观察PI和FITC的荧光滤片进行观察。

1．拍摄染色体照片并分析实验结果。

2．影响荧光原位杂交的因素有哪些？

实验操作中应注意哪些问题？

实验四Southern杂交分析

用限制性内切酶将DNA消化成一定大小的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离消化片段，再用毛细管转移等方法将变性的DNA片段转移到杂交膜上，最后用标记探针对固定在杂交膜上的DNA进行杂交，通过放射自显影等方法显示消化产物中与标记探针序列互补的目的条带。

Southern杂交法由英国Southern氏建立，是最常用的高级分子生物学技术之一，并在此基础上衍生出检测mRNA的Northern杂交法和检测蛋白多肽的Western杂交法。

Southern杂交分析的用途很广，主要用于基因组DNA消化片段、相互关系及长度多样性分析，转基因生物基因组中外源基因整合及整合位点的鉴定，以及基因操作过程中复杂基因构件的分析鉴定。

纯化的基因组DNA

三、溶液和缓冲液

1．限制性内切酶及其缓冲液

2．TAE电泳液：

50×

贮存液，pH约8.5：

Tris碱242g

冰醋酸57.1mL

Na2EDTA·

2H2O37.2g

加H2O至1000mL

1×

工作液：

40mmol/LTris·

Ac

2mmol/LEDTA

1mg/mLBSA（可选）

3．DNA分子量标准

4．6×

DNA加样液

5．TE缓冲液（pH8.0）

6．溴化乙锭染色液

7．0.2mol/L盐酸溶液

8．DNA变性液：

9．中和液：

10．20×

11．10%SDS

12．预杂交/杂交液

13．放射性标记探针

14．杂交膜洗涤液

水浴箱，水平电泳槽，电泳仪，玻璃或塑料盘，Whatman3MM或同等滤纸，杂交尼龙膜，水浴摇床，手提式放射性检测仪，X-光胶片及显影暗盒，EP离心管，微量移液器及吸头等。

1．在EP离心管中建立下列消化反应：

基因组DNA20mg

10´

缓冲液5mL

EcoRI酶100U

去离子水至50mL

EP离心管经短暂离心后，在37℃水浴中孵育4～8h。

将对于标准的Southern交来说，每凝胶孔的加样量约为10mg基因组DNA，考虑到消化过程中需进行电泳检查等因素，每消化反应需用约20mgDNA。

反应体系的体积应适当大些，以便基因组DNA充分溶解，必要时可用酒精沉淀消化产物，然后溶于20mL左右的TE缓冲液中。

基因组DNA是否消化完全除与限制酶的用量（一般为5U/mgDNA）有关外，还与消化时间有关，一般采取少用酶延长消化时间的方法。

2．制备0.7%琼脂糖凝胶，在较低电压（≤1V/cm胶）下电泳分离消化的DNA片段。

3．电泳结束后，取出凝胶，并进行溴化乙锭染色。

4．如果消化后的DNA片段大于15kb，将凝胶在0.2mol/L盐酸溶液中浸泡30min，以便提高DNA片段的转移效率。

小于15kb的DNA片段不需处理。

5．凝胶浸泡于10倍体积的DNA变性液中，在室温和缓慢摇动下变性45min。

6．上述凝胶取出，经去离子水短暂漂洗后浸泡于10倍体积的中和液中，在室温和缓慢摇动下中和30min，然后改换新鲜中和液，继续中和15min。

7．剪取一块较凝胶略大的电中性尼龙膜，将其漂浮在一盘去离子水的液面，直至由下而上完全湿润，然后再在转移液中浸泡5min以上。

为了便于位置和方向的辨认，通常将膜及凝胶的同一角切去一个同样大小的缺口。

8．凝胶中DNA向杂交膜的转移有电转移法和毛细管转移法。

后者是较为经典的方法，有朝上和朝下转移之分。

朝上转移的操作如下：

取一个较大的玻璃或塑料盒，中间以一块玻璃板为桥，盒中加以适量的10×

SSC，将一张滤纸与玻璃桥板呈十字形交叉放置，两端浸入转移液中，用吸管吸取转移液将滤纸浇湿，并用吸管赶去滤纸与玻璃板之间的气泡。

9．将上述凝胶（操作步骤6）反转置于玻璃板上湿润的滤纸上，凝胶的四周围以一层塑料薄膜或用过的X-光胶片条（与凝胶重叠3～5mm），用吸管吸取转移液使凝胶湿润，将上述尼龙膜（步骤7）放在凝胶上，再将转移液饱和的4片滤纸放在膜的上面。

在上述操作过程中，应用吸管赶去滤纸-凝胶-尼龙膜-滤纸之间的气泡。

最后将5～8cm高的一叠吸水纸巾置于湿润滤纸上，上面放置一块玻璃板，板上压以约400g重的物体（图5-2），在室温下转移过夜。

10．转移结束后，按与上述相反的步骤拆去转印装置，对转移后的凝胶可进行染色，以判定DNA是否转移完全。

图5-2DNA从凝胶向尼龙膜转移示意图

11．DNA与尼龙膜结合的方法有烘烤法和紫外交联法。

前者先将尼龙膜在室温的6×

SSC中浸泡1min，在吸水纸上晾干后，夹在两层滤纸的中间，在80℃真空烘烤炉中烘烤1～2h；

后者的做法是将潮湿的尼龙膜置于一张滤纸