蛋白质组分析文档格式.docx

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10kD～200kD

1,000

3,000

定量困难，方法的重复性差

荧光双向差示凝胶电泳（DIGE）

Cy-2，3or5fluorophores

标记伯氨基

10,000[6]

3,000[7]

适用于检测高表达水平、长半衰期的蛋白质

基于反相色谱的二维色谱系统[8]

＞5kD的肽或蛋白质

100

2,500

限于UV检测，未与MS联用

LC-MS/MS多维色谱系统（MudPit）

可以用N14/N15标记氨基酸

蛋白质经酶解后的多肽混合物

10,000[9]

872[10]

适用于较复杂的蛋白质混合物，进行MS分析前需进行分级分离

MALDI-TOF-MS

＞10kD，实际测定蛋白质经酶解后的多肽混合物

25

不适用

通过肽质量指纹图鉴定已分离的蛋白质

SELDI-TOF-MS[11]

＜40kD

利用蛋白质芯片对生物样品中蛋白质的质量进行分析

ICAT

分析技术

以ICAT试剂标记巯基

无数据

496[12]

适用于含巯基蛋白质的相对定量分析

cICAT

以可裂解的C12/C13ICAT试剂标记巯基

10,000

496

注：

2-DE，双向电泳（twodimensionalelectrophoresis）；

DIGE，荧光双向差示凝胶电泳（fluorescencetwo-dimensionaldifferentialgelelectrophoresis）；

MudPit，用于蛋白质分离的多维色谱（multi-dimensionalforproteinidentification）；

SELDI-MS，表面增强激光解吸离子化—质谱（surfaceenhancedlaserdesorptionionization-MS）；

基质辅助激光解吸离子化—质谱（MALDI-MS，matrix-assistedlaserdesorptionionization-MS）；

ICAT，同位素标记的亲和标签（isotope-codedaffinitytag）技术；

cICAT，可裂解的ICAT（cleavableICAT）技术；

PTM，蛋白质翻译后的修饰（posttranslationalmodification）。

用，但是在可测定的蛋白质分子量范围、动态范围、可分离的蛋白点数、适用范围等方面还不能完全达到蛋白质组学研究的要求。

图5.2展示出现行的生物分析化学/临床检验方法所能达到的灵敏度和分辨率，以及要实现蛋白质组学研究目标应该达到的灵敏度和分辨率。

图5.2蛋白质组学分析方法的灵敏度和分辨率

图A：

蛋白质组学方法的灵敏度。

深灰色框和浅灰色框表示目前各种分析方法（包括生物化学分析方法）所能达到的检测灵敏度，其中，深灰色框表示样品未经预分级或去除高丰度蛋白处理时的检测灵敏度，浅灰色框表示样品经过预分级或去除高丰度蛋白处理后的检测灵敏度；

白色框表示检测生物样品还需要达到的检测灵敏度。

图B：

蛋白质组学方法的分辨率。

深灰色框和浅灰色框表示目前各种分析方法（包括生物化学分析方法）所能达到的分辨率，其中，深灰色框表示样品未经预分级或去除高丰度蛋白处理时的分辨率，浅灰色框表示样品经过预分级或去除高丰度蛋白处理后的分辨率；

白色框表示检测生物样品还需要达到的分辨率。

a．经美国FDA核准的血浆诊断方法所能达到的浓度范围。

b．要检测一个哺乳细胞体积内（≈1x10−12L）只有一个拷贝或1ml血浆含有一个拷贝的蛋白质时，临床检验应达到的灵敏度。

c．未经样品前处理的一维蛋白质组分析（蛋白质经酶解后再作MS分析）所具有的分辨率。

d．多维蛋白质组分析（蛋白质经His-或Cys-标记/富集/RPHPLC-强阳离子交换色谱分离/MS/MS）所具有的分辨率。

e．包括基因以多种mRNA形式剪接、基因突变以及翻译后修饰所产生的蛋白质在内的分子数。

HAS：

人血清清蛋白；

IgG：

免疫球蛋白G；

TPA：

组织纤溶酶原激活物；

TNFα：

肿瘤坏死因子α

表5.1和图5.2表明，蛋白质组学研究对生物分析化学提出了很高的要求：

（1）对含有巨大数量的多蛋白质成分的复杂体系进行全分离是蛋白质组学研究迫切需要解决的问题。

（2）所建立的生物分析化学分离分析方法应具有很宽的动态范围，才能适应细胞内蛋白质组分析的要求。

（3）蛋白质组学研究对检测灵敏度也提出了很高的要求。

（4）原位、实时检测。

（5）对蛋白质相互作用的检测是蛋白质组学研究中一个非常重要的内容。

5.3蛋白质组学的分析策略与研究路线

蛋白质组学分析不是单一的方法学，而是各种分离分析技术、鉴定技术、生物信息学手段的有机整合，因此，它是一种分析策略。

5.3.1蛋白质组学的基本分析策略

电泳策略是目前常用的一种分析策略。

来自组织、体液或培养细胞裂解液（LyseCells）的样品经双向电泳分离成单一蛋白质，以酶切位点专一的蛋白酶水解成为肽的混合物，再以MALDI-TOF-MS测得蛋白质酶解肽段的精确质量数，在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽质量谱的蛋白质。

鸟枪法策略（shotgunanalysis）。

与电泳策略不同，在鸟枪法分析策略中，样品中的蛋白质混合物并不经过双向电泳的分离而直接进行酶解，产生总数可能超过1,000种的肽的复杂混合物。

然后，以多维色谱（如SCX离子交换色谱、反相色谱的二维分离）结合MS/MS，或液相色谱分离/离子迁移谱（ionmobilityspectrometry，IMS）结合MS/MS进行分离、分析，所得到的质谱数据通过数据库搜索确定肽序列，进而鉴定蛋白质。

TopDown策略中，并不经过酶解而直接获取蛋白质的质谱信息。

这种分析策略要求使用分辨率很高的质谱技术，如傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry（FTMS）），目前尚未得到广泛使用。

图5.3蛋白质组学分析的基本分析策略

53.2蛋白质组学的研究路线

目前，蛋白质组学研究有两条路线，一条路线类似于基因组学的研究，即力图查清人类3～4万个基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质数据库，从而获得有关生命活动的“全景式”信息。

这一研究路线在短期内尚不能完全实现。

另一条是基于比较的研究路线，称为比较蛋白质组学（comparativeproteomics），其中一种典型的基于电泳策略的研究路线如图5.5所示，并不需描述整个细胞或组织的全部蛋白质组，却非常关注在不同状态下蛋白质组的表达差异，特别适合于病理过程和药物干预过程的研究，因此，在生命科学的各个领域得到了广泛的应用。

图5.5比较蛋白质组学分析的研究路线

5.4双向电泳技术及其改进

双向电泳（twodimensionalelectrophresis，2-DE）是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。

目前所应用的二维电泳体系是由O’Farrell等人于1957年发明，其原理是根据蛋白质的两个一级属性（等电点和相对分子质量），将一种蛋白质样品进行两次电泳，即：

在第一个方向上按等电点高低进行分离，称为等电聚焦；

在第二个方向（与第一次电泳成直角的方向）上按相对分子质量大小进行分离。

蛋白质组学研究中用得最多的是由固相pH梯度等电聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing，IEF）/SDS-PAGE所构成的双向电泳体系。

5.4.1双向电泳的流程双向电泳的流程如图5.6所示。

5.4.1.1蛋白质样品的制备

有效的可重复的样品制备方法是2DE成功的关键，也是最困难的步骤。

样品可以是细胞、组织、分泌蛋白质、体液蛋白质等。

没有一种样品制备方法能够广泛地适用于各种各样的样品。

对于每一个有着不同要求的样品，都需通过具体的实验来摸索最合适的实验条件。

图5.6双向电泳流程图

（1）蛋白质样品制备的一般要求

①应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性；

②溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态，避免溶解性低的蛋白质（如膜蛋白）在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出；

③防止在样品处理过程发生蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰；

④排除核酸、多糖、脂类和其它干扰分子；

同时，应避免处理环境对蛋白质的污染；

⑤尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白在可检测水平；

⑥尽可能缩短处理样品的时间，尽可能在低温环境中处理样品。

（2）细胞或组织样品的破碎

样品破碎的方法以最小限度地减小蛋白质水解和其它形式的降解为原则，因此，破碎应在低温、含有裂解液的环境中进行。

组织样品往往来源于临床取材，其成分混杂、状态不一，处理不当会对蛋白质组分析的结果产生干扰。

因此，在取材时应尽可能地去除间质成分，对标本进行清洗以除去血液，并尽量刮取组织表面的细胞。

如果条件允许，可采用荧光标记的流式细胞仪（FACS）或激光捕获显微切割术（LCM）来获取纯净的细胞样品。

组织样品的细胞亦应在含有裂解液的环境中进行破碎。

（3）裂解

细胞裂解液含有变性剂、表面活性剂、还原剂、起载体作用的两性电解质以及蛋白质酶抑制剂，其组成见表5.2。

①变性剂

变性剂用于改变溶液离子强度和pH，破坏蛋白质-蛋白质相互作用；

通过改变溶液中的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白质充分伸展，并将其疏水中心完全暴露，降低

表5.2裂解液的组成

试剂

终浓度

用量

尿素＊

8molL-1

9.6g

CHAPS

4%

0.8g

二硫苏糖醇（DTT）

400mg

载体两性电解质pH3～10

2%

400μl

蛋白酶抑制剂

28μg

双蒸水

至20ml

接近疏水性氨基酸残基的能量域。

最常用的变性剂是尿素，其常用浓度为8molL-1，根据蛋白样品溶解的需要可增至9～9.8molL-1。

硫脲和尿素联合使用可以大大增加蛋白质，特别是膜蛋白的溶解性，一般用2molL-1硫脲和5～8molL-1尿素，高浓度尿素的使用是为了增加硫脲在水中的溶解性。

②表面活性剂

经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。

常用的表面活性剂有离子型表面活性剂SDS、非离子型表面活性剂TritonX-100和NP-40、两性离子表面活性剂3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）等，通常的使用浓度为0.5～4%。

为了提高膜蛋白的溶解性，并有助于膜蛋白质与脂类的分离，还可使用一些新的表面活性剂，如CHAPSO、TritonX-114、Tween80、C6BZ、CTAB、SB3-10、SB3-12等。

③还原剂

用于还原二硫键或防止蛋白质氧化。

在变性剂和表面活性剂联用条件下，还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。

常用有含自由巯基的的还原剂二硫苏糖醇（DTT）、乙二硫醇（dithioerythreitol，DTE）、β-巯基乙醇以及非离子型还原剂三丁基膦（tributylphosphine，TBP）。

④载体两性电解质

载体两性电解质（carrierampholytes）的作用在于屏蔽蛋白质分子表面的疏水基团，增加蛋白质分子的溶解度。

为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，应使载体两性电解质的pH值与之相符合。

⑤蛋白酶抑制剂

细胞破碎后，蛋白质水解酶被释放或被激活，这可能使双向电泳的结果复杂化。

因此，在裂解液还需加入抑制蛋白质水解的蛋白酶抑制剂。

一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此可考虑使用复合的蛋白酶抑制剂。

用于组织标本的裂解液与细胞样品的裂解液组成大致相同，但由于组织标本的复杂性，组织标本裂解液中可同时使用多种表面活性剂、蛋白酶抑制剂。

5.4.1.2固相pH梯度胶条的重泡胀与加样

5.4.1.3第一向电泳：

固相pH梯度等电聚焦

双向电泳技术中，第一向等电聚焦的过程是在固相pH梯度胶上进行的，其分辨率可达0.001pH。

表5.4IPG胶条的载样量

IPG干胶条长度

分析型电泳的荷载

（silverstaining）

制备型电泳的荷载

（coomassiestaining）

7cm

10～100μg/125μl

200～500μg/125μl

11cm

50～200μg/185μl

250～1000μg/185μl

17cm

100～300μg/300μl

1～3mg/300μl

5.4.1.4IPG胶条的平衡（IPGstripequilibration）

5.4.1.5第二向电泳：

SDS-PAGE

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）主要用于测定蛋白质亚基分子量。

SDS-PAGE成功的关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS结合的程度。

其影响因素主要有三个：

①溶液中SDS单体的浓度，为了保证蛋白质与SDS的充分结合，二者的重量比应为1:

4或1:

3。

②样品缓冲液的离子强度，常为10～100mmolL-1。

③二硫键是否完全被还原。

在SDS-PAGE中，凝胶浓度的正确选择尤为重要。

凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶；

凝胶浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着缓冲液流向前推进而不能得到很好的分离。

不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。

对于蛋白质组这样的具有不同迁移率的多组分样品，使用梯度胶是一种好的选择。

梯度胶浓度的选择主要根据样品的特性：

样品的分子量范围，样品组分电泳带的相对位置，感兴趣组分的分子量等。

根据这些因子选择梯度形式（线性梯度或指数梯度）和浓度梯度范围，具体内容见第四章。

5.4.1.6胶上蛋白质的检测（staining）

2-DE分离后，胶上蛋白点通过染色方法进行检测。

目前常用的方法有考马斯亮兰染色法、银染法、负染法、荧光探针标记法。

表5.5比较了几种常用染色方法的特点。

表5.5胶上蛋白染色方法的比较

考玛斯亮兰染色

银染

负染

荧光探针标记

优点

1.染色过程简单

1.在非放射性染色方法中灵敏度最高

1.专为提高PAGE胶上蛋白回收率设计，常用锌染

1.对蛋白质无固定作用

2.无毒性

2.成本较低

2.染色过程快

2.与质谱兼容性好

3.染色后的背景及对比度良好

3.线性范围宽

4.与鉴定兼容

缺点

1.检测灵敏度低

由于银染过程中醛类的特异反应，对凝胶酶切肽谱提取较难

灵敏度不够高

SYPRORuby染料成本很高，荧光扫描仪价格不菲

2.表达丰度低的蛋白质，用考染难以染色

5.4.2双向电泳图谱所传达的信息

图5.7展示了2-DE分离人肝细胞和血浆所得到的结果，横轴是等电点标度（pH从左至右增大），纵轴是相对分子质量标度（kDa由下至上增大）。

由双向电泳图可以得到：

①蛋白质的分布范围（偏酸性或偏碱性）；

②表达蛋白质的可能个数（凝胶点的数目）；

③蛋白质的大概相对分子量；

④蛋白质的大概等电点；

⑤蛋白质相对表达丰度（点的灰度值）等信息。

但是，通过双向电泳分离不能得到完整的功能蛋白质，得到的是构成蛋白质的各个亚基。

图5.7双向电泳例图

同一种蛋白质的不同修饰形式（如酰胺化与去酰胺化、糖基化、磷酸化、氧化和外源化学修饰等）具有不同的等电点，因此，在2-DE图像中处于不同的位置，在某些情况下，相同多肽所表现出的不同修饰形式可能显现为“点横向排列”。

这种分离对于鉴别蛋白质的不同存在形式是有用的。

5.4.3图像分析技术

“满天星”式的2-DE图谱中，每一个斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，因此，必须依靠计算机为基础的数据处理进行分析。

图像分析包括图像采集、背景消减、斑点配比、数据库构建。

常用的图像采集系统有电感偶合装置（chargecoupleddevices，CCD）、光密度仪、激光诱导荧光检测器等。

无论何种采集系统，都必须具备透射扫描的功能以获得较高的灵敏度。

图像采集的信息为光密度值，一般来说，该光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比。

影响图像采集质量的因素有：

扫描系统的分辨率、灵敏度，以及扫描时所选择的图像对比度和明亮度。

双向电泳图像分析通过软件的运行来实现。

软件分析所要做到的有以下几点：

蛋白质点数的统计；

蛋白质点的定位、编号；

相对丰度分析；

在进行差异蛋白质组分析时，则要对相互对照样品的凝胶图像进行同步分析，比较对应蛋白点的表达丰度，获得差异蛋白质点的缺失、出现以及表达量的变化等信息。

目前有多种图像分析软件可以使用，如表5.6所列。

表5.6用于2-DE图像分析的软件工具

软件名称

来源

应用

Fliker

NationalCancerInstitute（www.lecb.ncifcrf.gov/fliker/）

可视的胶-胶对比

PDQuest

Bio-Rad（）

凝胶图像比较

ImageMster

AmershamBiosciences（）

DeCyder

2D-DIGE分析＊

Melanie

Genebio（http:

//www.

Phoretix/Progenesis

NonlinearDynamics（http:

InvestigatorHTAnalyzer

GenomicSolutions（http:

ProteomeWeawer

Definiens（http:

Delta2D

Decodon（http:

＊2D-DIGE：

荧光双向差示凝胶电泳

5.4.4目前双向电泳技术存在的问题

（1）进行可完全重复的2-DE分析是困难的。

（2）许多较大的疏水蛋白质在IEF分析中的结果不理想。

（3）对相对分子质量过大（＞100,000）的蛋白质分离分析能力差。

（4）双向电泳不易实现自动化操作，因此，尚不能适应大规模蛋白质组分析的需要。

（5）双向电泳现有的主要染色技术（考玛斯亮兰染色、银染色）的检测灵敏度较差，且局限在约一百倍的动态范围，而细胞中蛋白质表达范围约为百万倍，而且，从胶上切割下的蛋白点消化后所产生的的肽的回收率常常低于60%，这更会妨碍MS对低丰度蛋白的鉴定。

因此，如果不对样品中提取的蛋白质混合物进行细致的分级和富集，双相电泳还仅仅是一种适合于长寿命、高丰度蛋白的分离技术。

如图5.8所示，若样品中有100,000个目标蛋白质拷贝时，胶上荷载的上样量需达到1mg才能保证考玛斯亮兰染色斑点的显现，这意味着要从1×

107个细胞中提取蛋白质；

同样情况下，显现银染色斑点的上样量要达到100μg以上，这意味着要从1×

106个细胞中提取蛋白质。

而对于低丰度蛋白质，如样品中只有1,000个目标蛋白质拷贝，胶上荷载的上样量需高达100mg才能保证考玛斯亮兰染色斑点的显现，这意味着要从1×

109个细胞中提取蛋白质；

同样情况下，显现银染色斑点的上样量要达到10mg以上，这意味着要从1×

108个细胞中提取蛋白质。

由于蛋白质样品不可能像核酸样品那样通过PCR扩增，所以，微量蛋白质样品中低丰度蛋白点的检测受到限制。

图5.8目标蛋白拷贝数与胶上荷载的由细胞提取的蛋白质量的关系

5.4.5双向电泳技术的改进

目标：

①提高分辨率，增加可分离的蛋白点的数目；

②提高低丰度蛋白点的可检出程度。

5.4.5.1三步提取法

在进行电泳之前，按照蛋白质溶解性能的不同，将样品的蛋白质组成分为三个部分后分别进行电泳，如图5.9所示。

使用了三种亲水/疏水性不同的提取液。

第一种提取液为pH9.5的Tris缓冲液，可将样品中40～80%的蛋白质提出；

第二种提取液为含有Urea/CHAPS/TrisBio-Lyte®

/TBP的缓冲液，可将样品中12～49%的疏水性较强的蛋白质提出；

第二种为提取液为含有Urea/thiourea/CHAPSSB3-10/TrisBio-Lyte®

/TBP的缓冲液，可将样品中5～8%的疏水性更强的蛋白质提出。

这种提取方法将样品中的蛋白质按疏水性加以分类，相应减少了每一次