免疫组织化学Word文档下载推荐.docx
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一、免疫细胞化学技术的概述
*免疫细胞化学（immunocytochemistry,
ICC）
-就是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂
显色来确定细胞内抗原的成分（主要就是多肽与蛋白质）,对其进行定位、定性及定量的研究,称为～。
（一）
对抗原与抗体的要求
*具有特异性高与亲与力强的抗体就是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求:
纯度高、比活性强;
*高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求:
纯度高,免疫原性强,稳定无变化。
（二）
抗原
（antigen,
Ag）
*抗原的概念:
凡就是在机体内引起体液免疫与（或）细胞免疫反应的物质,称为抗原。
抗原具有两个方面的特性:
-免疫原性:
引起机体产生抗体与（或）致敏淋细胞的特性;
-免疫反应性:
抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
*根据抗原就是否显示免疫原性分为:
-完全抗原:
分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的就是蛋白质抗原,多糖次之;
脂类与核酸必需与蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原:
又称为不完全抗原,分子量较小。
例如:
某些短肽、多糖、类脂与药物等。
*半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。
载
体
*通常就是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyhole
limpet
hemocyanin,KLH）、牛血清白蛋白（bovine
serum
albumin,
BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体
（antibody,
Ab）
1、抗体的概念:
*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内;
-抗体都就是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都就是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、
IgD、IgE、
IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体:
单克隆抗体与多克隆抗体。
*单克隆抗体:
就是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
-特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体:
就是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低,会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,就是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
*动物的选择
*佐剂（adjuvant）
*免疫方法
*免疫剂量
*抗体效价的测定
*放血或定期抽血
免疫组化常见问题及解决方法
当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
①
确认就是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②
确认所有的试剂就是否按正确的顺序加入,就是否孵育了足够的时间。
③
对照抗体的标签确认就是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统就是否与一抗匹配,这一点就是非常重要的。
比如,如果一抗就是兔来源的抗体,二抗一定要用抗兔的二抗来匹配;
或一抗就是小鼠的IgM一抗,二抗必须就是山羊/兔抗小鼠的IgM（不就是IgG）二抗。
④
检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤
检查抗体的有效期与保存条件,尤其就是标记了酶或荧光素的抗体,现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。
⑥
检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦
检查色原/底物溶液,最简单的检测方法就是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中,如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物的因素。
需要注意的就是,有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完,否则会失效。
⑧
检查冲洗液就是否与反应试剂匹配,溶液的pH值很重要,与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨
检查复染剂与封片剂就是否与所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性,除了考虑上述因素外,还应考虑:
标本的固定方式,不当的固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测的抗原的数量与质量。
不适当的抗原修复方式,由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用,必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法,至于使用哪一种方法,应参照生产厂家的说明,同时结合标本的具体情况而定。
抗体的稀释度就是否过高或者孵育的温度/时间就是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围,但就是由于使用者的标本来自各种组织,处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度测试,找出最佳的使用浓度。
切片上遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
孵育时切片就是否放置水平,否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而标本弱阳性,则可能就是由于阳性对照不就是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
就是否有效地去除了内源性酶与生物素。
应注意的就是,并不就是每一种组织均需要进行此步骤,但对于内源性酶或生物素丰富的组织,如肝脏、肾脏等,需考虑此原因。
处理的方法为:
灭活碱性磷酸酶:
最常用的方法就是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中,并保持pH值在7、6~8、2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶,对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶,可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱与处理内源性生物素:
消除内源性生物素的方法就是事先滴加亲与素,以饱与内源性生物素,使之不再有剩余的结合位点。
具体方法就是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲与素溶液中处理15分钟,PBS清洗15分钟后即可染色。
就是否选择使用了正确的封闭血清。
电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法就是以二抗动物的非免疫血清,用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片,以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白,如牛血清白蛋白也常应用。
另外,取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭,效果也不错。
所选择的抗体就是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
一抗的使用浓度就是否过高。
清洗就是否充分。
应严格操作规程。
因在缓冲液中含有一定量的盐,这亦有利于减低背景着色,通常0、05mol/l
Tris—HCl,0、15mol/l
NaCl已适用于多数染色方法,溶液内加入吐温20,效果更佳。
特殊标记时,试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
DBA的使用就是否正确。
DAB的孵育时间与配制方式可以产生某些背景颜色,使用浓缩型DAB试剂盒时,请严格按照说明书标明的滴加顺序操作,注意校正蒸馏水的pH值,以确保实验结果的正确性;
粉剂DAB溶解时,常有一些不溶性颗粒,这些颗粒须经过滤除去,否则可能沉积于切片组织上,产生斑点状着色。
另外,DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上,因此需将DAB保存于避光干燥处,现用现配,临用前加H2O2。
孵育时间过长也会造成背景染色。
标本染色过程中就是否曾经干涸,否则会造成边缘部的非特异性染色。
检查二抗与标本的内源性组织蛋白就是否有交叉反应。
抗体的保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成,常用的有聚丙烯,聚碳酸酯与硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附,隔离蛋白常用0、1%-1、0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下,以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
抗体原液与已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下,并避免反复冻融。
冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻,应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果,应将污染的抗体溶液及其她试剂弃之。
为防止细菌污染,可于抗体溶液中加入0、01%叠氮钠。
抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀释后的单抗应加入0、1%叠氮钠浓度。
大多数稀释抗体可进行冷冻保存,少数抗体可能会丢失抗原活性。
大多数单抗,只要蛋白浓度适当,可在4℃下保存数月。
石蜡切片免疫组化染色步骤
1、载玻片的处理:
抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。
为保证试验的正常进行,可选用我公司提供的ZLI-9001
APES、ZLI-9003
HistogripTM或ZLI-9005
Poly-L-Lysine等几种试剂,对已清洗的载玻片进行处理。
具体方法如下:
1、1
APES:
现用现配。
将洗净的玻片放入以1:
50比例丙酮稀释的APES中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,置通风橱中晾干即可。
用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。
1、2
HistogripTM:
50比例丙酮稀释的Histogrip液中,停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时,装盒备用。
1、3
Poly-L-Lysine:
将洗净、干燥的载玻片放入以1:
10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡5分钟,60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。
装盒备用。
试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化:
2、1
胰蛋白酶:
一般使用浓度为0、05%~0、1%,消化时间为37℃、10~40分钟,主要用于细胞内抗原的显示。
2、2
胃蛋白酶:
一般使用浓度为0、4%,消化时间为37℃、30~180分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:
Laminin（层粘蛋白）,Collagen
IV（IV型胶原）等。
2、3
g/ml的saponin溶液,消化时间为室温孵育30分钟。
m皂素（Saponin）:
一般使用浓度为2~10
3、抗原热修复:
可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金属盐溶液等,但实验证明,以0、01M枸橼酸盐缓冲液（pH6、0）效果最好。
请选用我公司提供的ZLI-9064
±
枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制,取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中,混匀,其pH值在6、0
0、1,如因蒸馏水本身造成的pH值偏差,请自行调整。
3、1
石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:
切片脱蜡至水后,3％H2O2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×
3。
将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意:
无论就是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度与时间的要求）。
取出容器,室温冷却10~20分钟（注意:
不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。
PBS洗,下接免疫组化染色步骤。
3、2
石蜡切片高压抗原修复操作方法:
切片脱蜡至水。
将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。
切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。
当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后）,计时1~2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS洗2分钟×
3,下接免疫组化染色步骤。
3、3
石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:
切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟,然后端离电炉,室温冷却20~30分钟,蒸馏水冲洗,PBS洗,下接免疫组化染色步骤。
4、免疫组化染色步骤:
（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
1）石蜡切片脱蜡至水。
2）3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。
3）
蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,（如需采用抗原修复,可在此步后进行）。
4）
5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭,室温孵育10分钟。
倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5）PBS冲洗,5分钟×
3次。
6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释）,37℃孵育10~30分钟;
或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。
7）PBS冲洗,5分钟×
8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）,37℃孵育10~30分钟;
或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。
9）
PBS冲洗,5分钟×
10）
显色剂显色（DAB或AEC）。
11）自来水充分冲洗,复染,封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×
用3％过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗,5分钟×
2
免疫组化实验过程中的要点与技巧
1、固定:
最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片,甲醛固定有时比冰冻丙酮好;
但对于不同的组织与抗原,可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液,请于购置前注意说明书。
Bouin
S固定液:
饱与苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整,但因偏酸,对抗原有一定损害,且组织收缩明显,不适于组织标本的长期保存。
PLP液:
即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛,适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2.组织脱水,透明:
时间不能太长,否则在切片时容易碎片,切不完整。
3.切片时展片:
有些组织在切片后难以在水中展开,这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4.烤片:
60℃
30分钟或37℃
过夜,温度太高或时间太长,抗原容易丢失。
5.蜡块及切片的保存:
最好在4℃保存
6.脱片问题:
Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:
10稀释成60ml的工作液,适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行,可用双重处理（APES与Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下,可用如下方法:
切片在脱蜡前,放在APES
1:
50
丙酮溶液中浸泡3分钟,晾干,即可进行下一步。
7.灭活内源性酶:
HRP系统:
3%双氧水灭活;
AP系统:
3%HAc灭活。
8.暴露抗原:
对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度（不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书）。
对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。
胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9.封闭:
在山羊血清封闭,非特异性染色仍然较强时,可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10.抗体稀释:
应遵循“现用现配”的原则,对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11.背景高:
在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下,如果背景依旧高,可采用含1‰
Tween20的PBS洗,特别就是在显色之前要多洗。
12.返蓝:
在苏木素复染后,可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱与溶液返蓝。
13.显色:
一定要在显微镜下观察,注意控制背景。
14.在整个操作过程中,切片千万不能干燥,否则会有非特异性染色。
免疫组织化学方法及常见问题解答
按染色步骤可分为直接法（又称一步法）与间接法（二步、三步或多步法）;
按结合方式可分为抗原-抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法与亲与连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等,其中SP法就是最常使用的方法。
免疫组化ABC法步骤
1、4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。
蜡块制作。
切片,贴片。
0、01MKPBS清洗5min×
3后;
2、加入配好的0、3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml+0、01MKPBS100ml+30%过氧化氢）30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,0、01MPBS清洗5min×
3;
3、加入配好的0、3%TritonX100（30%TritonX100+0、01MKPBS100ml）30min,以增加细胞的通透性,0、01MKPBS清洗5min×
4、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1、00g+0、01MPBS100ml+叠氮纳0、08g）稀释的一抗,4℃存放24-48h;
吸去抗体,0、01MKPBS洗5min×
5、加入0、01MKPBS稀释的的二抗,室温孵育2h。
0、01MKPBS洗5min×
6、加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2h,0、01MKPBS洗5min×
蒸馏水迅速冲三次;
7、加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入0、01MKPBS终止反应;
8、梯度酒精脱水之后,封片,拍照。
免疫组化SP法步骤:
SP（streptavidin-perosidase）法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。
一般的sp法步骤啊,具体如下:
1、烤片,68℃,20分钟,
2、常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;
二甲苯I20min⇒二甲苯II20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%酒精5min⇒70%酒精5min
3、阻断灭活内源性过氧化物酶:
3%H2O237℃孵育10min,PBS冲洗3X5min;
4、抗原修复:
置0、01M枸橼酸缓冲液（PH6、0）中用煮沸（95℃,15-20min）,自然冷却20min以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5min。
5、正常羊血清工作液封闭,37℃10min,倾去勿洗。
6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）;
滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min,PBS冲洗3X5min;
7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min,PBS冲洗3×
5min;
8、DAB/H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片。
免疫组化方法中关键环节及其原理解述
一、酶免疫组化的关键环节
1、标本固定:
固定的目的就是①防止标本从玻片上脱落;
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;
③固定的标本易于保存。
2、脱水、石蜡包埋与制片:
脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净与锋利。
否则,容易裂片与脱片等。
3、脱蜡与水化:
这就是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。
脱蜡可以先60度20min,然后立即二甲苯1-3分别10min,但当天制好的切片可以60度3-4h。
水化用梯度乙醇（由高到低）。
若脱蜡与水化不全易出现局灶性反应与浸洗不全,而产生非特异性背景着色。
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性;
通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。
常用的修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。
修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料,大量的:
中性的、高pH的等）。
我们实验室一般用微波修复中火6min*4次,效果不错。
注意微波修复后自然冷却30min左右（只要您觉得修复液的温度达室温即可）。
5、细胞通透:
目的就是使
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