实时定量PCR实验故障排除Word格式文档下载.docx

实时定量PCR实验故障排除Word格式文档下载.docx

《实时定量PCR实验故障排除Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时定量PCR实验故障排除Word格式文档下载.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

没有扩增曲线

原始数据只有1个循环Spectra

只有1个循环的数据原因：

1.收集数据的步骤只有一个循环，只收集了一个数据点

2.电脑为了节省电源而休眠，通讯中断，1个循环后的数据丢失

原因1：

PCR参数设置错误

原因2：

硬盘休眠

从原始数据找原因

从第1-第9个循环，ROX的信号升高并逐渐下降。

在所设定的4-13基线范围内，ROX信号值是变化的，而FAM的信号值基本上是固定的，经过FAM/ROX的校正后，比值自然不相等，所以基线不是水平的直线，而有下滑部分。

ROX的信号变化与所用试剂的质量有关。

应该取10-20为合理的基线范围。

解决方法

修改基线范围为10-20，重新分析。

重新分析的结果

基线范围取10-20，重新分析后的图谱。

第1-9循环的信号为负数，由于试剂质量引起。

增曲线分成两段扩增曲线断裂

原因：

基线的终点大于CT值，

通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值<

15，而基线仍然取3-15，

其中包含部分扩增信号，导致标准偏差偏大，阈值过高

解决方法：

减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据

样品浓度跨度太大

直线扩增曲线

探针部分降解

V形扩增曲线

扩增微弱或者信号很弱

ROX信号不稳定

扩增曲线不光滑

信号太弱

•使用高质量的探针

•补救方法：

1.7000的SDS软件升级到v1.1

2.关闭ROX校正，重新分析数据

关闭ROX校正的效果

ROX帮助故障诊断

（1）

现象：

重复性很差

正常的原始数据

盖子未盖紧，溶液蒸发

排除蒸发的数据后

ROX帮助故障诊断

（2）

山坡形扩增曲线

原始数据显示有蒸发

引物二聚体SYBRGreenI®

化学，Dissociationcurve试验

•推荐措施：

提高引物设计质量，

避免形成引物二聚体

•补救措施：

优化引物浓度和退火温度

•也许：

专设80度步骤收集信号？