分子生物学.docx

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操纵子：

原核生物中由一个或多个相关基因以及转录、翻译、调控原件组成的基因表达单元。

内含子：

一个基因中非编码DNA片段，它分开相邻的外显子，内含子是阻断基因线性表达的序列。

外显子：

是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。

弱化子：

原核生物操纵子中能显著减弱甚至终止转录作用的一段核苷酸序列，该区域能形成不同的二级结构，利用原核微生物转录与翻译的偶联机制对转录进行调节。

顺式作用元件：

是指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率，顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。

顺式作用：

顺式作用元件对基因表达起调控作用的过程。

增强子：

增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列，因为它能强化转录的起始，又称强化子。

反义RNA:

为大肠杆菌编码许多小分子mRNA，它们能也不同的mRNA结合，从而在翻译水平上正调控和负调控，可能关闭SD序列和释放SD序列，由于这些小分子通过与反义RNA进行碱基配对结合来行使功能。

重叠基因：

是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分；重叠基因有多种重叠方式。

常见于细菌和噬菌体的基因组中。

核糖开关：

mRNA一些非编码区的序列折叠成一定的构象，这些构象的改变应答于体内的一些代谢分子，从而通过这些构象的改变达到调节mRNA转录的目的

回文序列：

双链DNA中的一段倒置重复序列；两条链从5‘到3‘方向阅读序列一致，从3‘到5‘方向的序列一致

转座子：

插入序列，复合型转座子。

效应：

引起突变，产生新的基因，产生染色体畸变，引起生物进化

魔斑核苷酸：

细菌生长过程中在缺乏氨基酸供应时产生的一个应急产物。

主要是三磷酸鸟苷合成的四磷酸鸟苷和五磷酸鸟苷。

主要功能是干扰RNA聚合酶与启动子结合的专一性，诱发细菌的应急反应，帮助细菌在不良环境条件下得以存活。

反式作用因子：

是指能结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控基因转录效率的蛋白质或RNA。

RNA聚合酶是催化基因转录最主要的酶。

基因沉默：

真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除细胞中非正常RNA的一种机制；分为转录水平基因沉默和转录后基因沉默。

RNA干扰：

是指双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解技术，而使相应基因表达沉默。

单顺反子mRNA:

只编码一种蛋白质的mRNA。

原核生物染色体的特征：

结构简单，存在转录单元，有重叠基因。

DNA的修复：

错配修复，切除修复，重组修复，DNA的直接修复，SOS反应。

玉米中的转座子：

自主性，具有自主剪接和转座的功能；非自主性，单独存在时是稳定的，当基因组中存在与非自主性转座子同家族的自主性转座子时，才具备转座功能。

RNA的转录：

是按5＇→3'方向合成的，以DNA双链中的反义链为模板，根据碱基配对原则，合成的RNA带有与DNA编码链相同的序列。

包括模板识别、转录起始、转录延伸、转录终止。

真核生物mRNA的特征：

1.5'端存在帽子结构，常常被甲基化，使mRNA免遭核酸酶的破坏2.具有多（A）尾巴。

蛋白质的生物学合成：

氨基酸活化、肽链的起始、伸长、终止，新合成多肽链的折叠和加工。

内含子的剪接：

内含子特点：

长度和序列没有共同性，一般有16-46个核苷酸；位于反密码子下游；内含子和外显子没有保守序列。

tRNA核酸内切酶切割前体分子中的内含子，RNA连接酶将外显子部分连接在一起

真核生物染色体的组成：

明显核结构，组蛋白和非组蛋白，染色质和核小体。

特征：

1分子结构相对稳定

2,能够自我复制，使亲子代之间保持连续性

3能够指导蛋白质的合成，控制整个生命过程

4，能够产生可遗传的变异。

重叠基因的重叠方式：

1，一个基因完全在另一个基因里面，如基因a在基因b中

2.部分重叠，如基因k和基因c部分重叠

3.两个基因只有一个碱基对的重叠

DNA的二级结构：

指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成双螺旋结构。

1.DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。

2.DNA分子中的核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。

碱基通过氢键相结合，形成碱基对，A和T配对，G和C配对，A-U。

真核生物三种RNA聚合酶的特点

RNA聚合酶Ⅰ位于核仁里，转录产物是45SrRNA，经剪接修饰后生成除5SrRNA外的各种rRNA。

rRNA与蛋白质组成的核糖体是蛋白质合成的场所。

RNA聚合酶Ⅱ位于核质上，在核内转录生成hnRNA，经剪接加工后生成的mRNA被运送到胞质中作为蛋白质合成的模板。

RNA聚合酶Ⅲ位于核质上，转录产物是tRNA，5SrRNA,snRNA，其中snRNA参与RNA的剪接

双螺旋模型的意义：

改模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征；确认了碱基配对的原则，这是DNA复制，转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息的传递和表达的分子基础。

●细菌的应急反应：

1.细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，不是缺少一两种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。

为了紧缩开支，渡过难关；细菌会产生一个应急反应；包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内几乎全部生化反应过程均被停止。

实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（PPGPP）和鸟苷五磷酸（PPPGPPP），产生这两种物质的诱导物是空载RNA.

2.当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使鸟苷四磷酸（PPGPP）大量合成，其浓度可增加10倍以上，鸟苷四磷酸（PPGPP）的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。

一般认为RNA聚合酶有不同的构型。

这些构象可以识别不同的启动子区，鸟苷四磷酸（PPGPP）与RNA聚合酶结合会使它的某些构象稳定下来，从而改变基因转录的效率。

同时基因转录起始点附近有一些保守序列，它们可能是鸟苷四磷酸（PPGPP）有关调节蛋白的结合位点。

当这些序列与鸟苷四磷酸（PPGPP）结合后，就不能与RNA聚合酶相结合，使基因被关闭。

鸟苷四磷酸（PPGPP）和鸟苷五磷酸（PPPGPPP）的作用范围十分广泛；它们不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批；所以它们是超级调控因子。

●PCR技术：

PCR：

又称多聚酶链式反应，如果设计一对寡聚核苷酸引物与目的DNA互补，以至于能被DNA聚合酶相向延伸，那么该引物结合的模板区就可以通过变性，引物退火和聚合的循环来大量扩增，这反应称为PCR，是分子生物学中一种克隆及基因分析的必要工具

原理：

DNA复制

前提：

一段已知目的基因的核苷酸序列

原料：

模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子

过程：

变性、退火、延伸三步曲

变性：

加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA

退火：

冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合

延伸：

加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

PCR过程：

在第一个循环中，目的DNA在加热至95℃，典型的为60s左右的条件下分解成两条链。

当降温至55℃（约30s）时，引物实现与模板DNA退火，实际退火温度依引物长度和序列而定。

退火后再升温至72℃，以进行最后的聚合反应。

这一步需要消耗反应中的dNTP，并需要Mg离子。

在第一次聚合反应中，不同的目标分子从引物位点开始扩增不同长度，直至第二次循环开始第二次循环，温度再次升高至95℃，使新合成的分子变性。

第二次退火时，反应液中的另一引物与新合成链结合，经聚合反应扩增模板至第一个引物的末端。

所以在第二次循环后，就合成了新的正确长度的分子。

在之后的循环，正确长度的分子在长度各异的分子中占优势，且每次循环中数量会增加两倍。

如果PCR效率为100%，n次循环后单个目的分子就会扩增2的n次方。

实际中通常循环为20-40。

PCR引物设计原理：

为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

PCR引物的设计原则：

1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

2.产物不能形成二级结构。

3.引物长度一般在15~30碱基之间。

4.G+C含量在40%~60%之间。

5.碱基要随机分布。

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8.引物5′端可以修饰。

9.引物3′端不可修饰。

10.引物3′端要避开密码子的第3位。

●乳糖操纵子：

（1）乳糖操纵子的组成：

大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I.

（2）阻遏蛋白的负性调节：

没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。

所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。

（3）CAP的正调节：

在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡糖糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。

（4）协调调节：

乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。

葡萄糖抑制了lac操纵子基因的表达。

半乳糖将在gal操纵子的作用下再转化成葡萄糖。

葡萄糖效应（答到乳糖操纵子里面）

1.当葡萄糖缺乏时，大肠杆菌细胞内的cAMP水平上升，CRP结合到cAMP上。

CRP-cAMP复合物可结合到紧邻RNA聚合酶结合位点上游的乳糖操纵子的启动子。

Plac上的CRP的结合引起DNA链发生90度弯曲，这就增强了RNA聚合酶与启动子的结合，使转录效率提高了几倍。

2.当葡萄糖（G）存在时，大肠杆菌不需要乳糖这样的替代碳源。

因此，乳糖操纵子不会被激活。

这种调节由CRP介导，但以二聚体形式存在的CRP蛋白自身不能独立与DNA结合，也不能调节转录。

G会降低cAMP的水平。

●弱化子模型

1.RNA聚合酶启动色氨酸操纵子的转录

2，在转录约90nt以后RNA聚合酶暂停在第一个二级结构处。

3，核糖体开始于新生的mRNA结合，启动前导肽的合成

4，RNA,从暂停状态解除，继续转录

5、RNA聚合酶到达潜在终止子区域时，是继续转录还是停止转录取决于取决于紧随其后的核糖位的位置。

6、如果细胞缺乏色氨酸，核糖体就会停留在2个连续的色氨酸密码子的位置，等待色氨酸tRNA进入A位，那么1区被隔离在核糖体内，无法与2区配对，2区和3区在4区被转录之前发生配对，使后面转录出的4区以单链的形式存在，这就组织了3区和4区形成终止子的结构，转录继续。

7、如果细胞色氨酸含量充足，核糖体能连续的翻译出前导肽，就会覆盖2区，阻止2区和3区的配对，于是4区转录之后，就自发的与3区形成终止子结构，导致转录的提前结束。

产生约140bp的产物。

●衰减子对色氨酸操纵子的表达调控（色氨酸操纵子调节模型）

色氨酸操纵子结构：

色氨酸操纵子包含操纵基因O启动子P,及5个结构基因A、B、C、D、E.E与O之间有一段前导序列L.色氨酸操纵子上游存在调节基因R,编码阻遏蛋白.

衰减调控：

Ｌ中含有4段特殊序列：

序列1编码一个前导肽,前导肽的第10、11位是色氨酸；序列2-3或序列3-4可形成茎环结构.3-4