新型氨气传感器检测肺炎克雷伯菌的应用.docx

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新型氨气传感器检测肺炎克雷伯菌的应用

新型氨气传感器检测肺炎克雷伯菌的应用

摘要:

提出了一种通过自行研制的聚苯胺/TiO2-PQC新型氨气传感器来实现迅速定量检测肺炎克雷伯菌的方法。

该方法是利用肺炎克雷伯菌在有尿素的存在下能够产生大量的氨气和二氧化碳,此时产生的氨气能够与自制的聚苯胺/TiO2-PQC氨气传感器反应,并引起其表面电参数的变化,信号通过电脑输出,从而达到检测肺炎克雷伯菌的目的。

经过研究结果显示,与SPQC相比新方法操作简单,更加灵敏以及不需要特定的培养基等特性,而且能够实现定量实时监测肺炎克雷伯菌。

关键词:

聚苯胺/二氧化钛肺炎克雷伯菌检测鉴定SPQC

近年来属于革兰阴性菌败血症的肺炎克雷伯菌败血症发生率成上升趋势,并且对抗菌药物耐药性也不断攀升[1],这样就给临床治疗带来非常大的困难。

目前临床上主要采用的是费用昂贵且操作复杂的表型确证试验,双纸片法,聚合酶链反应（PCR）,质粒提取等技术[2],这些技术的操作方法的复杂程度及费用的昂贵都局限其使用。

因此提出肺炎克雷伯菌检测方法是具有价格便宜,操作简单且检测速度快是非常具有意义的研究。

本文提出了一种新型串联式压电氨气传感器来实现实时快速检测肺炎克雷伯菌,该传感器是通过串联修饰了聚苯胺/TiO2复合材料[3]的叉指电极与石英晶体所构成的。

该方法具有检测速度快,操作简单,在线监测的特点,为临床诊断致病菌肺炎克雷伯菌提供很好的检测方法。

1实验部分

1.1细菌和化学试剂

菌种:

肺炎克雷伯菌（来自湖南省儿童医院）。

化学试剂:

钛酸四丁酯（天津市科密欧化学试剂有限公司,AR）;苯胺单体（AR）;盐酸（AR）;过硫酸胺（AR）;无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂,AR）;聚二烯丙基氯化铵（PDDA）（美国Aldrich公司,AR）;聚对苯乙烯磺酸钠（PSS）（美国Aldrich公司,AR）;氨气,二氧化碳,氮气（均由大连海得气体股份有限公司提供）。

1.2培养基

用来储藏菌种的培养基－营养肉汤NB:

依次向锥形瓶中加入5.0g氯化钠,5.0g牛肉浸膏,10.0g蛋白胨,1000ml去离子水,通过高温高压锅经过121℃灭菌冷却后,调溶液pH为7.4。

YC肉汤培养基[4]:

依次向锥形瓶中加入1.0g酵母浸膏,2.0g牛肉浸膏,10.0g葡萄糖,16.0ml氨基酸以及用孔径为0.2μm的微孔滤膜过滤除菌后浓度为20g/L的尿素,再加入去离子水1000ml,通过高温高压锅经过121℃灭菌冷却后,调溶液pH为7.4。

1.3实验装置

实验装置[5]如图1所示（1.恒温水浴套2.大检测室;3.小检测室;4.培养基;5.聚四氟乙烯膜（PTFE膜）;6.聚苯胺/TiO2电极;7.气体入口;8.气体出口）。

该装置是由检测单元,振荡器,电脑以及频率计数器组成。

整个检测单元的构成步骤如下:

首先把培养基和细菌放在大检测室中,接着用孔径为0.2μm的聚四氟乙烯（PTFE）膜密封小检测池的底部,然后将其插入到培养基约0.5cm深处,最后把检测氨气的探针—聚苯胺/TiO2电极放在小检测室中（切忌该电极不要接触到培养基液体）。

检测整个流程如下:

先后将培养基和细菌接种到大检测室中,当在生长代谢过程中细菌会产生大量的氨气,此时氨气就会透过PTFE膜进入小检测室随即就会与电极上的聚苯胺/TiO2接触发生反应,引起电极表面电参数的变化,接着这种变化就会通过IC-TTC振荡电路和石英晶体转换为频率的变化,同时电脑记录数据。

（整个实验过程中,恒温水浴套将装置恒温控制在37℃）。

1.4聚苯胺/二氧化钛复合材料和聚苯胺材料的制备[6]

1.4.1二氧化钛溶胶的制备

A液:

用移液管精确移取1.0ml钛酸四丁酯溶液并缓慢价加入到无水乙醇中,同时不断搅拌,大约搅拌15min后静置放置,备用。

B液:

用移液管分别移取7.5ml无水乙醇,2.5mlHNO3到烧杯中,大约搅拌15min后静置放置,备用。

二氧化钛溶胶（AB混合液）:

接着把B液缓慢的滴加到A液中,并用磁力搅拌器连续搅拌4h,随后放置24h,备用。

1.4.2聚苯胺的合成

在室温条件下,首先将20ml2mol/L的盐酸溶液加入到烧杯中,然后向其中逐滴的加入0.45ml的苯胺单体并不断的搅拌,当混合均匀后向该溶液中再逐滴缓慢的滴加10.0ml的过硫酸胺HCl溶液,当观察到溶液的颜色变为蓝黑色时则表示聚苯胺材料已经合成完成了。

1.4.3聚苯胺/二氧化钛复合材料的合成

0.1wt%的TiO2溶胶的制备:

在室温条件下,移区体积为1.0ml自制的TiO2溶胶加入到9.0ml蒸馏水中然后经过超声15min,冷却静置备用。

首先,将20ml20mol/L的HCl溶液加入到烧杯中,然后依次向其中加入把自制的0.1wt%的TiO2溶胶,0.45ml苯胺单体,然后不断搅拌,最后将10ml过硫酸胺HCl溶液缓慢滴加到混合溶液中,当观察到溶液颜色变为蓝黑色时则表示聚苯胺/二氧化钛复合材料合成完成。

1.4.4复合薄膜敏感电极的制备

（1）叉指电极的清洗。

依次把叉指电极放在0.5mol/LH2SO4溶液,二次蒸馏水,无水乙醇中超声清洗5min,然后用氮气吹干备用。

（2）自组装气敏薄膜。

依次将清洗干净的叉指电极浸入到1.0wt％PDDA水溶液中保持15min,取出用去离子水冲洗,用氮气吹干,再将该电极浸入到2mg/mlPSS溶液中15min,取出用去离子水冲洗并吹干,备用。

复合薄膜的自组装示意图如图2所示。

1.5实验过程

在无菌操作台中,分别依次向两个大检测池中加入3.0mlYC肉汤培养基,0.5ml20.0g/L尿素和0.5ml检测菌,然后在小检测池中插入探头PANI和PANI/TiO2,接着把该小检测池固定在大检测池中。

在整个实验过程中MSPQC系统自动实时的记录这细菌的每个生长代谢过程,并通过自带软件得到频移-时间的响应曲线（）,从而实现实时监测细菌的生长过程。

2结果与讨论

2.1实验原理

在有尿素的培养基中,肺炎克雷伯菌在生长代谢过程中能产生大量的氨气和二氧化碳,如下式子所示:

而当自制的PANI/TiO2-PQC氨气传感器接触到肺炎克雷伯菌代谢过程中释放出来的氨气时会引起电极表面电参数的变化如图3所示,这种变化通过石p

2.3PANI/TiO2修饰电极检测肺炎克雷伯菌的响应曲线

图4是PANI/TiO2修饰电极检测肺炎克雷伯菌的典型响应曲线。

从图5可知,整条曲线分成三段。

第一段（cd段）:

曲线比较平稳,是由于细菌刚刚处于复苏期生长代谢缓慢,从而释放的NH3微乎其微,导致频率没有变化。

第二段（de段）:

该段频率开始变化较快被称为激活阶段。

是由于细菌经过cd段的复苏后进入到了迅速生长期,因此在该阶段细菌不断分解培养基中的营养成分,释放出大量的NH3,导致频移发生巨大变化。

第三段（ef段）:

曲线又开始变为平稳。

是由于在该阶段细菌逐渐停止生长因而放出的NH3也减少,膜的电参数变化较小,所以频率也无明显变化。

2.4PANI/TiO2－PQC传感器检测不同浓度肺炎克雷伯菌

何凤姣等[7,8,9]总结出FDT值与细菌的初始浓度值关系如下式,其中（FDT是指频移出现突变的点）:

A、B是常数,微生物的初始量可通过MSPQC[10]的频率曲线计算出。

细菌开始数目大,细菌生长的就快,FDT就短。

图6A表示的是聚苯胺/TiO2-PQC传感器对不同浓度肺炎克雷伯菌的频移响应曲线。

而图6B则表示的是不同浓度肺炎克雷伯菌的浓度值的对数与FDT之间的线性关系。

从图6A可以看出细菌初始浓度越高,则FDT越短。

从图6B可以看出肺炎克雷伯菌浓度的对数与FDT之间存在线性关系方程为（R2=0.99078）,那么通过该线性方程式我们就可以实现定量检测肺炎克雷伯菌。

2.5检测培养基对PANI/TiO2修饰电极检测肺炎克雷伯菌的影响

本实验是通过对比SPQC[11,12]和PANI/TiO2氨气传感器在加有尿素的营养肉汤（NB）和YC肉汤的培养基来检测肺炎克雷伯菌的情况。

根据实验结果可知,两种培养基检测的结果显示表明新方法的灵敏度大于SPQC法,并且SPQC法只能用于YC肉汤培养基,而新方法既能用于NB培养基也能用于YC培养基。

另外,从图7中还可以发现用营养肉汤和YC肉汤这两种培养基检测肺炎克雷伯菌的FDT明显比用YC肉汤要小。

所以,新方法与SPQC法相比,灵敏度高,并且对培养基没有限制,而且可以实现更快的检测细菌。

3结语

本文利用导电聚合物聚苯胺-TiO2复合材料对氨气的特异性响应,结合了串联式压电传感器对电导频率的响应原理,自行研制了新型聚苯胺/TiO2-PQC氨气传感器实现了实时快速检测肺炎克雷伯菌的研究应用。

通过依次讨论了聚苯胺/TiO2氨气传感器对肺炎克雷伯菌的响应曲线分析,二氧化碳影响情况分析,不同浓度肺炎克雷伯菌的检测分析以及不同培养基对该传感器在检测肺炎克雷伯菌中影响的研究。

研究结果表明,与SPQC相比,聚苯胺/TiO2氨气传感器的方法更加灵敏,不需要专门的培养基,而且可以更加快的检测细菌,并且对肺炎克雷伯菌的检测范围能实现在3.3×10～3.3×107cfu/m,实现定量分析。

综上所析,可以预测聚苯胺/TiO2-PQC氨气传感器在临床病菌的检测上能够得到很好的应用。

参考文献

[1]李娟,王晓辉,吕晓菊.成人肺炎克雷伯菌败血症53例临床分析[J].中国抗生素杂志,2008（8）:

491-494.

[2]汪玥,孙自镛,陈中举,等.碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌耐药机制研究[J].中华检验医学杂志,2012,35（4）:

339-344.

[3]太惠玲,谢光忠.聚苯胺二氧化钛复合薄膜的制备及其气敏性能[J].物理化学学报,2007,23（6）:

883－888.

[4]林丽.多通道串联式压电传感器在微生物检出鉴定中的应用研究[D].长沙:

湖南大学化学化工学院,2010:

30-31.

[5]任佳丽.新型压电微生物传感仪及其在临床分析中的应用研究[D].长沙:

湖南大学化学化工学院,2009:

4-91.

[6]苏碧桃,敏世雄,余世雄,等．导电聚苯胺/TiO2复合纳米纤维的制备和表征[J]．西北师范大学学报:

自然科学版,2006,142（14）:

67-70.

[7]张玲玲.新型压电气体传感器在微生物检测方面的应用研究[D].长沙:

湖南大学化学化工学院,2007:

2-43.

[8]涂金荣.串联式压电传感器在细菌及病毒检测中的应用研究[D].长沙:

湖南大学化学化工学院,2010:

4-36.

[9]HeFJ,GengQ,ZhuW,etal.RapiddetectionofEscherichiaColformusingaseparatedelectrodepiezoelectriccrystalsensor[J].AnalyticaChimicaActa,1994,289（3）:

313-321.

[10]ZhangJZ,WeiWZ.Monitoringofmutagenicprocesswithpiezoelectricquartzcrystalimpedanceanalysis[J].Talanta,2000,55（3）:

525-533.

[11]ZhangJZ,XieYT,WeiWZ.Aseriesofpiezoelectricquartzcrystalmicrobialsensingtechniqueusedforbiochemicaloxygendemandassayinenvironmentalmonitoring[J].MicrochemicalJournal,