第5章 沉淀技术 06Word文档格式.docx
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采用盐析法从鸡蛋壳中提取溶菌酶和采用乙醇分级沉淀血浆蛋白。
由于蛋白质是两性生物大分子电解质，在水溶液中，蛋白质表面存在不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区。
蛋白质和氨基酸一样，既含有酸性的基团又含有碱性的基团，在特定的pH范围内能解离产生带正电荷或带负电荷的基团。
对于某一特定蛋白质而言，当在某一pH时，其所带电荷正负相等（即静电荷为0），这一pH值被称为蛋白质的等电点（PI）。
蛋白质处于等电点时，其电导率、渗透压，粘度及溶解度等性质均处于最低值，因此，通常利用蛋白质的两性解离和等电点特性来沉淀蛋白质。
牛奶酪蛋白的等电点沉淀。
当天然蛋白质受到某些物理因素（加热、紫外线、X射线和超声波处理等）和化学因素（强酸、强碱、尿素、乙醇和TCA等）的影响后，由于氢键、盐键等次极键维系的高极结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使其生物学性质，物理化学性质改变。
这种现象称为蛋白质的变性作用。
变性蛋白质的理化性质均发生改变，最显著的是溶解度降低、粘度增大、分子扩散速度增大、渗透压降低、等电点改变、生物活性降低或丧失和易被酶水解等。
因此，在制备酶制剂或生物活性物质时应防止蛋白质变性的发生。
但蛋白质的变性作用可用于选择性变性沉淀中去除杂质。
从啤酒酵母泥中提取醇脱氢酶就是采用选择性热变性沉淀的方法去除杂蛋白。
综上所述，由于蛋白质周围的水化层和蛋白质分子间的静电排斥作用是防止蛋白质沉淀的两种屏障。
因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ξ电位），来降低蛋白质溶液的稳定性，从而实现蛋白质的沉淀。
水化层厚度和ξ电位与溶液性质（如电解质的种类、浓度、pH等）密切相关，所以，蛋白质的沉淀可采用恒愠条件下添加各种不同试剂的方法，如加入无机盐的盐析法、加入酸碱调节溶液pH的等电点沉淀法、加入水溶性有机溶剂的有机溶剂沉淀法等来实施。
二、各种沉淀技术
1盐析法
盐析沉淀工艺常在发酵液预处理之后，操作步骤通常按三步进行：
首先加入沉淀剂，第二步为沉淀物的陈化，第三步为离心或过滤，收集沉淀物。
加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。
由于盐析沉淀的产物中盐含量较高，一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作（如层析、结晶）。
1.1盐析的机理
当向蛋白质溶液中逐渐加入电解质时，开始蛋白质的溶解增大，这是由于蛋白质的活度系数γ降低的缘故，这种现象称为盐溶；
当继续加入电解质时，由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出憎水区域，憎水区域间的相互作用，使蛋白质的溶解度减小，而蛋白质发生聚集而沉淀的现象，称为盐析。
因而蛋白质的溶解度与离子强度的关系曲线上存在最大值，该最大值在较低的离子强度下出现，在高于此离子强度的范围内，溶解度随盐离子强度的增大迅速降低，如图1所示。
图1碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图[B3]（pH6.6，25℃，S0=17g/L）
S（g/L）-碳氧血红蛋白浓度；
r/2-离子强度=1/2∑miz2；
mi-溶液中离子的摩尔浓度；
z-离子所带电荷数。
β-常数，即截距，代表理想状态时纯水中碳氧血红蛋白浓度的对数；
Ks-盐析常数，曲线的斜率。
因此，可以把盐析机理归纳为如下三点：
①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白质表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；
②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。
盐析沉淀的机理示意于图2。
图2盐析机理示意图[B3]
由于盐析现象还不能很好地从理论上进行解释，现在常用Cohn方程式logS=β-KsI说明。
式中：
S（g/L）-蛋白质的溶解度；
I-离子强度=1/2∑miz2；
β-常数，与盐的种类无关，但与温度和pH有关；
Ks-盐析常数，与盐种类和蛋白质有关，与温度和pH无关。
因此，用盐析法分离蛋白质时可以有两种方式：
①在一定的pH及温度条件下，改变盐浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为Ks盐析，常用于蛋白质的粗提。
②在一定的离子强度下，改变溶液的pH及温度达到沉淀的目的，称为β盐析，常用于蛋白质的精制、纯化。
1.2溶解度曲线和盐析分布曲线：
对于特定的蛋白质，在一定的操作条件下，产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即每一特定的蛋白质均具有一定的蛋白质溶解度曲线（S-P曲线）。
通常，由实验可直接作出无机盐饱和度P对蛋白质溶解度S的曲线，即配制一系列具不同（NH4）2SO4饱和度的蛋白质溶液，并离心除去蛋白质沉淀，然后分别测定上清液中蛋白质浓度，即可作出S-P的曲线，如图3所示。
图3不同蛋白质的溶解度曲线[5]
从图3可见，当蛋白质溶液体系达到一定的盐浓度时，蛋白质才开始沉淀（图3中C0点）。
在此之前，无论如何增加盐浓度均不会发生蛋白质的沉淀现象，但是，一旦蛋白质开始沉淀，则蛋白质溶解度将很快下降，沉淀大量产生。
蛋白质沉淀的速度可用该曲线的斜率（-dS/dP）对盐饱和度（P）作图来表示。
此时，图3可转变为图4的形式。
图4蛋白质的盐析分布曲线
从图4可见，蛋白质沉淀的速率开始时十分迅速，以后逐渐变慢，因此从起始沉淀到沉淀结束，形成了具有尖峰的曲线，这就是蛋白质的盐析分布曲线。
该曲线的峰宽由Cohn经验式中的Ks决定。
而峰在横轴上的位置则由β值和蛋白质起始浓度决定。
利用不同蛋白质盐析分布曲线在横轴上的位置不同，可采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质，以达到分离目的。
图5（a和b）分别表示相等浓度（30g／L）血清白蛋白和碳氧肌红蛋白的溶解度曲线和盐析分布曲线，可见两个蛋白质盐析分布曲线尖峰的位置分得很开，沉淀发生在两个不同的阶段，血清蛋白在碳氧肌红蛋白出现沉淀以前就已完全地沉淀出来，因此这两种蛋白质能得到很快分离。
图5等浓度血清白蛋白和碳氧肌红蛋白的溶解度曲线（a）和盐析分布曲线（b）
但是，有时候各种具有不同的β和Ks值的蛋白质（图6）混杂在某一体系中，若欲从该体系中分离纯化各蛋白质就不是那么容易了，必须综合依序采取Ks盐析、β盐析和二次盐析的方法予以解决，这方面的例子将在后续的章节中进行讨论。
图6不同蛋白质的溶解度与硫酸铵浓度关系[2]
1.3盐析的主要影响因素
从图6可见，不同蛋白质对盐析的影响反映在Cohn方程中就是对β和Ks的影响：
不同蛋白质的β值不同；
Ks值随蛋白质分子量的增大或分子不对称性的增强而增大，即盐析沉淀结构不对称的高分子量蛋白质所需的盐浓度较低。
对于特定的蛋白质，影响蛋白质盐析的主要因素有无机盐的种类、浓度、温度和pH值。
（1）无机盐种类的影响
在相同的离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同。
从不同种类的盐对碳氧血红蛋白溶解度的影响（图7）可见，盐的种类主要影响Cohn方程中的盐析常数Ks（即曲线的斜率）。
图7不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）[B32]
（○）NaCl;
（▼）KCl;
（◘）MgSO4;
（▲）NH4）SO4;
（●）Na2SO4;
（□）K2SO4;
（■）柠檬酸三钠
因此，在选择盐析用盐时，要考虑不同种类各种离子的盐析效果，常见阴离子的盐析效果顺序为：
PO43->
SO42->
CHCOO->
Cl->
NO3->
ClO4->
I->
SCN-；
常见阳离子的盐析作用的顺序为：
NH4+>
K+>
Na+>
Mg2+。
除此之外，还要求①盐析用盐溶解度大，能配制高离子强度的盐溶液；
②盐溶解度受温度影响较小；
③盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离。
表1所示为生物分离领域常用的盐析盐对碳氧血红蛋白的盐析效果的比较。
表1常用的盐析盐对碳氧血红蛋白的盐析效果比较
硫酸铵
硫酸钠
硫酸镁
磷酸钾
柠檬酸钠
β
3.09
2.53
3.23
3.01
2.60
Ks
0.71
0.76
0.33
1.00
0.69
由于硫酸铵价格便宜，溶解度大且受温度影响很小、具有稳定蛋白质（酶）的作用，因此是最普遍使用的盐析盐。
但硫酸铵有如下缺点：
硫酸铵为强酸弱碱盐，水解后使溶液pH降低，在高pH下释放氨，硫酸铵的腐蚀性强，后处理困难：
残留在食品中的少量的硫酸铵可被人味觉感知，影响食品风味；
临床医疗有毒性，因此在最终产品中必须完全除去。
（2）温度和pH的影响
盐析操作的温度和pH是除盐的种类外影响盐析效果的重要参数。
温度和pH对蛋白质溶解度的影响反映在Cohn方程中是对β值（即曲线的截距）的影响（图8-9）。
在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大，但在高离子强度溶液中，升高温度有利于某些蛋白质的失水，蛋白质的溶解度反而下降（图8）。
图8温度对溶解度的影响
β随pH的变化很大。
在pH接近蛋白质等电点的溶液中蛋白质的溶解度最小（β值最小），所以调节溶液pH在等电点附近有利于提高盐析效果（图9）。
图9pH对β的影响
因此，蛋白质的盐析沉淀操作需选择合适的pH和温度，使蛋白质的溶解度较小。
同时，盐析操作条件要温和，需在较低温度下进行，不能引起目标蛋白质的变性。
（3）蛋白质起始浓度的影响
蛋白质起始浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。
提高蛋白质起始浓度可减少盐用量。
图10表示两种不同浓度的碳氧肌红蛋白盐析分布曲线的变化。
当浓度为30g/L时，使蛋白沉淀的（NH4）2SO4饱和度约58％～65％，但若稀释10倍，在此饱和度范围内并无沉淀，而在（NH4）2SO4饱和度约为66％时才开始出现沉淀,其沉淀范围变为60％～73％。
图10不同浓度碳氧肌红蛋白盐析分布曲线
由此可见，蛋白质的沉淀范围不是固定的，而是与蛋白质的起始浓度有关。
在实际操作中，如要将盐析分布曲线互相重叠的两个蛋白质分级沉淀，则可将该溶液适当稀释，就可能使重叠的曲线拉开距离而达到分级目的，这就是所谓的二次盐析沉淀。
但是，若沉淀的目的不是为了分离蛋白质，而是制取成品，那么料液中蛋白质浓度适当提高会使盐析收率提高和耗盐量减少，但过高的蛋白浓度会导致沉淀中杂质增多。
1.3盐析操作
在实际料液体系中，进行目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可以通过实验进行确定。
现以硫酸铵为盐析盐，介绍蛋白质盐析沉淀操作的经典设计方法和步骤，其操作程序如下（设操作温度为0℃）[B1]：
（1）取一部分料液，将其分成等体积的数份，冷却至0℃；
（2）计算饱和度达到20%～100%所需加入的硫酸铵量，并在搅拌条件下分别加到料液中，继续搅拌lh以上，同时保持温度在0℃；
（3）3000g下离心40min后，将沉淀溶于2倍体积的缓冲溶液中，测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度（如有不溶物，可离心除去）；
（4）分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒，检验分析结果的可信度；
（5）以饱和度为横坐标。
上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标作图，如图11所示。
图中纵坐标为上清液中蛋白质的相对浓度（与原料液浓度之比）。
图11盐析沉淀平衡后上清液中蛋白质浓度与硫酸铵饱和度关系
表2为文献报导的部分盐析沉淀分级纯化蛋白质的结果。
表2蛋白质的盐析沉淀纯化
在本实验室进行酵母扁桃酸脱氢酶提取时，取酵母细胞破碎后的混合液，离心除细胞碎片，将上清液，分成等体积的数份。
在充分搅拌和45℃条件下，分别逐步加入所需的硫酸铵，使硫酸铵终浓度达0～80％，12000g离心10min，取上清液。
测定上清液中总蛋白含量和扁桃酸脱氢酶活力。
实验表明扁桃酸脱氢酶沉淀所选择的硫酸铵饱和度范围为30～55％。
若采用35～50％硫酸铵分级沉淀，可得纯度较高的扁桃酸脱氢酶沉淀物。
2、等电点沉淀
较低离子强度的溶液中蛋白质的溶解度较小，蛋白质在pH为其等电点的溶液中净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低（图12）。
利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度最低的原理进行沉淀的方法称为等电点沉淀法。
等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白），而对于亲水性很强的蛋白质（如明胶），由于在水中溶解度较大，在等电点的pH下不易产生沉淀。
虽然等电点沉淀法不如盐析沉淀法应用广泛，但与盐析法相比，等电点沉淀无需后继的脱盐操作，可直接转入后续的纯化阶段。
图12大豆蛋白质溶解度与pH的关系
等电点沉淀操作需在低离子强度下调整溶液pH至等电点使蛋白质沉淀，由于一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内，故等电点沉淀操作中，多通过加入盐酸，磷酸和硫酸等无机酸调节pH。
①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原实例：
猪胰脏中提取胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质（pI=3．O）。
工业生产胰岛素（pI＝5.3）时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质（同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果）。
②PI沉淀提取碱性磷酸酯酶实例：
发酵液调pH4.0，出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。
用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。
3、有机溶剂沉淀
用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质。
有机溶剂沉淀是指在蛋白质溶液中，加入与水互溶的有机溶剂，显著地减小蛋白质的溶解度而发生沉淀的现象。
有机溶剂沉淀法常适用于蛋白质、酶、核酸、多糖等物质的提取。
由于本法的机理和盐析法不同，可作为盐析法的补充。
有机溶剂沉淀是由于加入有机溶剂于蛋白质溶液中能产生多种效应，这些效应结合起来，使蛋白质发生沉淀。
尤其是水的活度的降低。
当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大；
同时在增水区域附近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使该区域在有机溶剂中的溶解度提高，发生聚集而沉淀。
一般来说，在低离子强度和等电点附近，沉淀易于生成，所需有机溶剂的量较少。
蛋白质的分子量越大，有机溶剂沉淀越容易，所需加入的有机溶剂量也越少。
与盐析法相比，有机溶剂密度较低，易于沉淀分离，沉淀产品不需脱盐处理。
但该法和等电点沉淀一样容易引起蛋白质变性，必须在低温下进行。
酪蛋白是牛乳中主要蛋白质，是一组含磷蛋白混合物，其等电点为4.8，且不溶于乙醇。
可结合PI沉淀和有机溶剂沉淀的方法进行制备。
PI沉淀制备酪蛋白工艺为：
牛乳加热到40℃，搅拌下调pH=4.8，静止15min后过滤，收集沉淀即为酪蛋白粗品。
粗品用少量水洗涤后悬浮于乙醇中使成10%终浓度，抽滤去除脂类溶质，滤饼再用乙醇-乙醚混合液洗涤2次后抽滤、烘干，即得酪蛋白纯品。
多糖类药物主要来源于动物、植物、微生物和海洋生物，可分为低聚糖、均多糖和杂多糖等三种。
目前，动物来源的肝素、鲨鱼骨粘多糖、甲壳素、壳聚糖、硫酸软骨素和透明质酸等杂多糖仍主要是从动物材料中提取、纯化获得，提取时主要采用碱解和酶解方法，而多糖纯化则可采用乙醇分级沉淀、季胺盐络合沉淀合离子交换层析等方法。
以猪肠粘膜为原料酶解-树脂法提取肝素工艺（图13）包括：
肠粘膜胰酶酶解、大孔树脂吸附和分级洗脱、乙醇沉淀、脱水、干燥得粗品、高锰酸钾氧化脱色、乙醇二次沉淀、干燥成粉。
图13采用酶解-树脂法从猪肠粘膜中提取肝素工艺
4、选择性热变性沉淀：
在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的选择性热变性沉淀，来分离纯化热稳定性高的目标产物。
酵母醇脱氢酶的制备。
与前述的各种热力学沉淀方法不同，热沉淀是基于蛋白质的变性动力学。
其过程可用阿累尼乌斯（Arrhenius）方程表示：
KD＝Zexp（-E/RT）
Z-频率因子；
E-变性活化能；
R-气体常数；
T-绝对温度。
从式可以看出，若频率因子Z值相差较小，变性活化能小的蛋白质热敏性高，在较高温度下变性速率快。
因此，变性活化能差别较大的蛋白质可利用热沉淀法分离。
由于变性活化能可通过调节pH或添加有机溶剂改变，故调节pH或添加有机溶剂也是诱使杂蛋白变性沉淀的重要手段。
纯化红细胞酶可采用添加氯仿振荡的方法除去血红蛋白杂质。
必须指出，选择性热变性沉淀是一种变性分离法，使用时需对目标产物和共存杂蛋白的热稳定性有充分的了解。
选择性变性沉淀提取醇脱氢酶实例：
酵母干粉中加入0.066mol/L磷酸氢二钠溶液，37℃水浴保温2h，室温搅拌3h，离心收集上清液，升温至55℃，保温20min后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。
5.其他沉淀法
（1）非离子型聚合物沉淀法
非离子型聚合物、聚电解质和某些多价金属离子可用作蛋白质的沉淀剂。
许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。
聚合物的作用，被认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。
此现象和两水相的形成有联系。
使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量PEG；
而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。
PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用，既是蛋白质的稳定剂，也能做蛋白质的促沉淀剂。
最常用的PEG的分子量是6000和20000，所用的PEG浓度通常20%，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。
由于PEG对后继分离步骤，影响较少，因此可以不必除去。
（2）聚电解质沉淀法
聚电解质对蛋白质的沉淀作用机理与絮凝作用类似，同时还兼有一些盐析和降低水化等作用。
利用聚电解质的沉淀方法主要应用于酶和食用蛋白的回收，常用于回收食品蛋白的聚电解质有酸性多糖和羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐和卡拉胶等。
缺点是往往会使蛋白质结构改变。
（3）金属离子沉淀法
某些金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发生相互作用而使蛋白质沉淀。
例如，Ca2+和Mg2+能与羧基结合，Mn2+和Zn2+能与羧基、含氮化合物（如胺）以及杂环化合物结合。
金属离子沉淀法的优点是可使浓度很低的蛋白质沉淀，沉淀产物中的重金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。
6.凝聚和絮凝技术：
凝聚指在中性盐的作用下，由于双电层排斥电位的降低而使胶体体系不稳定的现象。
通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中的正离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层，但这些正离子还受到使它们均匀分布开去的运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分：
吸附层和扩散层，这样就形成了扩散双电层的结构模型。
如图14所示。
电动电位ξ是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征，并作为研究絮凝机理的重要参数，而且ξ在实际中是可测的。
胶粒能保持分散状态的原因主要有二：
首先是由于带有相同的电荷和扩散双电层的结构，其次是由于胶粒表面的水化作用，形成了包围于粒子周围的水化层，以致于阻碍胶粒间的直接聚集。
但一旦ξ电位降低，水化层也随之减弱。
发酵液中加入高价阳离子导致凝聚作用的原因是降低电动电位ξ和脱除了胶粒表面的水化膜，从而致凝聚现象的发生。
根据静电学基本原理可推导出电动电位ξ的基本公式：
ξ=4πqδξ/D
δ=[1000DkT/（4πNe2）]1/2*1/（Ci*Zi2）
从公式中可见，ξ与扩散层厚度δ，电动电荷密度q成正比，而与价数Zi和溶液中的粒子速度Ci成反比。
一般的ξ越小则越易凝聚。
凝聚值是指使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mM），它用来表示电解质的凝聚能力，一般的反离子价数越高，则该值越小，其凝聚能力越强。
阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为：
Al3+>
Fe3+>
H3+>
Ca2+>
Mg2+>
Li+；
常用的絮凝剂：
Al2（SO4）3.18H2O（明矾），AlCl3.6H2O,FeCl3,ZnSO4,MgCO3。
絮凝是指在某些高分子絮凝剂的存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理集合为主的过程。
其机理是：
应用水溶性的有机高分子聚合物絮凝剂，通过静电引力，范德华分子引力和氢键的作用，强烈地吸附在胶粒表面。
一个高分子聚合物的许多链接分别吸附在不同颗粒的表面上，产生了架桥连接，生成粗大的絮团。
如图15所示。
常用絮凝剂有：
聚丙烯酰胺衍生物，苯乙烯类衍生物及其无机高分子聚合物絮凝剂，天然有机高分子絮凝剂等。
其中天然有机高分子絮凝剂主要有明胶、海藻酸钠、骨胶、甲壳素、壳聚糖等。
7.沉淀技术的综合应用：
不管是盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性变性沉淀法，还是等电点沉淀法，各种方法都有自身的局限性。
在实际应用时，多种沉淀方法相结合是一个发展方向。
如前文所述的结合PI沉淀和有机溶剂沉淀的方法制备酪蛋白就是很好的例子。
这方面的例子还有很多：
①溶菌酶的分离纯化就综合使用了盐析沉淀、pI沉淀和晶种起晶等方法。
室温下鲜鸡蛋清搅拌5min后，绢布去除脐带块，100rpm搅拌条件下，缓慢加入鸡蛋清体积5％的NaCl粉末，溶解混匀后，滴加1mol/LNaOH调pH值到10左右，加入少量溶菌酶纯品作晶种，于4℃冰箱中冷却结晶。
必要时可把结晶粗品重新溶于pH4-6溶液中，重复上述步骤进行重结晶。
②胸腺素的分离纯化就综合使用了盐析沉淀、pI沉淀、有机溶剂沉淀和选择性变性沉淀等方法。
胸腺素是由80℃热稳定的多种活性多肽组成的混合物，相
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