根系活力测定方法Word文档格式.docx

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30

40

蒸馏水

35

0

α-萘胺标准曲线的绘制

试管号

１（对照）

２

３

４

５

６

α-萘胺（ml）

１（水）

１

磷酸缓冲液（ml）

蒸馏水（ml）

15

对氨基苯磺酸（ml）

100ppm亚硝酸钠（ml）

混匀，置室温（20~25度）下５分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml,

摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为０，读取光密度，以α-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。

（2）将待测根系吸净吸干附着水称取1g放入100ml三角瓶中，加40ppm的α-萘胺溶液和磷酸缓冲液各25ml，混匀。

（3）静置5-10分钟后（根吸附以完毕），从瓶中取2ml溶液放入25ml容量瓶。

将其余的溶液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在25℃下震荡3-6小时（如无震荡器时要在反应期间，定时的摇动），反应时间完毕后，再取2mL溶液放入另一刻度试管，因为α-萘胺溶液会自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；

用切碎的根，α-萘胺溶液的氧化量会意外增加）。

（4）在上述两次及空白试验所吸取的2ml测定液中，各加入10ml蒸馏水，混匀后再加入1%对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml，混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为25ml，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出α-萘胺含量。

也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为准确些）。

（5）结果计算

根系对α-萘胺的生物氧化量Y（ug.g-1.h-1）按下式进行计算

Y=[（A-B）-（C-D）]*E/（t*W）

式中：

A-第一次取液测定值（ug.ml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应；

B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的α-萘胺浓度（ug.ml-1）。

A-B即α-萘胺氧化总量；

C-第一次空白测定值（ug.ml-1）；

D-第二次空白测定值；

C-D即α-萘胺自发氧化量；

E-稀释倍数24（48/2）（因从48ml中又取2ml）；

t-3小时；

W-样品鲜重（也可以用干重计算）；

实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法

[原理]：

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。

NR的测定可分为活体法和离体法。

活体法步骤简单，适合快速、多组测定。

离体法复杂，但重复性较好。

[试剂]

1．亚硝酸钠标准溶液：

准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；

2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：

Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；

3．1%（W/V）溶液：

1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml3mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol.L-1HCL）；

4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：

0.020g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中；

5．0.1mol.L-1KNO3溶液：

2.5275gKNO3溶于250Ml0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；

6．0.025mol.L-1Ph8.7的磷酸缓冲液：

8.8640gNa2HPO4.12H2O，0.0570gKH2OP4.3H2O，溶于1000ml去离子水中；

7．30%三氯乙酸溶液：

30g三氯乙酸。

水溶后定容至100ml。

[方法]

1.标准曲线制作：

管号

1234567

试剂（ml）

亚硝酸钠标准液

1%磺胺

0.02%萘基乙烯胺

每管含亚硝态氮（ug）

00.20.40.81.21.62.0

2.01.81.61.20.80.40.0

4444444

摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。

以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。

2.样品中硝酸还原酶活力测定

1.在取材的前一天加50mmol/LKNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。

2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中1份作对照，另外2份作酶活性测定用。

3.反应：

先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml0.1mol/LKNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。

4.比色测定：

将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入1ml萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min，后比色，540nm

5.空白溶液：

2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。

同样和样液一样进行水浴15min。

三、结果计算

单位鲜重样品中硝酸还原酶活性

[μg/（g.h）]

为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg；

V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml；

V2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml；

W为样品鲜重，g；

t为反应时间，h。

实验三外渗电导法

方法：

1.清洗用具：

三角瓶一定要清洗干净。

2.取样与浸泡，最好用完整叶和根，以消除伤口的影响，用天平准确称取一定量的材料（如0.1-1.0g）对应放入已编号的三角瓶中，加入一定量的去离子水浸泡，自然浸泡2小时，可在震荡器上震荡，注意：

各处理浸泡时间和测定温度要一致，一般应在室温条件下进行。

3.测定电导率：

在测定前先将各管浸泡上下搅拌或摇匀再测定电导率，为了测定相对外渗电导值，需将测国电导率的材料，再放入沸水中煮沸10-20分钟，冷却至室温后再测一次总电导率值。

4.电解质外渗量的表示：

直接用电导率值表示

电解质渗出率（%）=浸泡液电导率值/煮沸后电导率值*100]

温度校正：

X25=At[1+0.02（t-25）]

X25为校正成25℃时的电导率，At为在t℃下实测电导率值。

参考《植物生理学实验技术》张宪政P333，辽宁科学技术出版社

实验四、植物中氮磷钾元素的测定

一、代测液制备：

1、硫酸—过氧化氢消煮法

试剂配制：

（1）浓硫酸：

分析纯

（2）30%过氧化氢

测定步骤：

称取0.5000-1.000克（通过0.42mm孔径）样品置50ml小开氏瓶中，用少量水湿润样本后，加入浓硫酸5ml，摇动使硫酸与样本混合，放置半小时或过夜，在电炉上加热至瓶内硫酸开始回流（消化液呈酱红色，冒大量白烟），微沸5min，取下冷却，逐滴加入30%H2O2约0.5ml，再加热微沸5min，取下稍冷却，添加H2O2，反复操作，直至消化液完全清亮为止（最高温度不要超过350度）。

添加H2O2量应每次逐渐减少。

最后一次应微沸5min，以除尽剩余的H2O2。

冷却后先加入10ml蒸馏水，再无损地移如100ml容量瓶中定容，摇匀备用。

（注意：

H2O2不能沾在开氏瓶上，以免影响磷的测定）

二、氮的测定

用2NKCl提取：

取新鲜土壤10g，放入100ml三角瓶，加入2NKCl50ml，用橡皮塞塞紧，振荡30分钟，立即过滤于50ml三角瓶中（含量第可以2.5：

1）

A试剂：

1）复合液：

28gNOH、5gNa2EDTA.2H2O和50g酒石酸钾钠溶于1L去离子水中，保存于棕色瓶中。

2）催化液：

150g水杨酸钠和0.3g硝普钠溶于1L去离子水中，保存于棕色瓶中。

3）显色液：

200gNOH和250g苯酚定溶到1L，保存于棕色瓶中。

4）混合液：

催化液和显色液1：

1混合，用前进行配制。

5）次氯酸溶液：

60ml5.25%次氯酸钠溶液稀释到1L，保存于棕色瓶中。

6）氮标准液：

a：

2.5mgNH4+-N/ml储备液：

11.79g（NH4）2SO4定容到1L。

b：

10ugNH4+-N/ml工作溶液：

吸收1ml储备液，稀释到250ml。

B步骤

1）打开分光光度计，预热30分钟。

2）吸收1ml样品液加入10ml容量瓶或刻度试管中。

3）吸收0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ml工作溶液加入10ml容量瓶中，铵离子的浓度分别为0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ug/ml。

若超过0.8ug/ml，就不成线形关系。

4）加入5滴0.25%正硝基酚；

5）用5NNOH中和。

在碱性条件下，溶液显黄色；

6）加入1ml复合液和1ml的混合液，摇匀；

7）加入1ml次氯酸钠溶液，摇匀；

8）稀释到10ml，室温放置60min后，在626nm处比色；

9）绘制工作曲线，并寻找样品氮浓度。

C计算：

含氮率（mg/kg）=（C*Vs）/Ws

C：

标准曲线上查的铵浓度（ug/ml）Vs：

样品溶液总体积（mL）Ws：

样本重量。

紫外分光光度法测定硝态氮

1、试剂：

1）氮标准储存溶液[p（N）=100mgL-1]，称取0.7218g硝酸钾（KNO3，分析纯），溶于水中，转人1000mL容量瓶中，定容摇均。

2）氮标准溶液[p（N）=10mgL-1]：

将氮标准储存溶液准确稀释10倍。

2、操作步骤：

1）工作曲线：

吸取氮标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL分别于50mL的比色管中，用水定容至刻度，得到氮的标准系列溶液0mgL-1、0.2mgL-1、0.4mgL-1、0.6mgL-1、0.8mgL-1、1.0mgL-1、1.2mgL-1，测定A220和A275。

以A（A=A220-A275）为纵坐标，氮的浓度为横坐标绘制工作线。

2）直接吸收样品溶液测定A220和A275，根据样品A值（A=A220-A275）查得测定液的浓度。

3、计算结果

p（N）=pV/W

p（N）：

样品中总氮含量，mgkg-1

p：

从工作曲线中查得氮浓度mgL-1

V：

提取液体积，mL

W：

样品重量，g

注意：

1、两测定方法中，标准溶液的配制均应用提取土壤的氯化钾溶液进行配制。

2、铵态氮的测定中：

2）2ml样品加入到20ml的刻度试管中。

3）吸取0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.4ml工作溶液加入20ml容量瓶中，铵离子的浓度分别为0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ug/ml。

8）稀释到10ml，室温放置60min后，比色；

三、植物全磷的测定（H2SO4-H2O2消煮-钒钼黄比色法）

原理：

待测液中的正磷酸盐能和偏钒酸盐在酸性条件下作用形成黄色的杂聚化合物钒钼酸盐，溶液的黄色很稳定，其深浅与磷含量成正比，可以用比色法定量磷。

比色时根据所用比色计的型号和溶液中磷浓度选用波长400-490nm（紫-蓝）或相应的滤光片。

试剂配制：

1．标准曲线：

（1）50ppm磷（P）标准液：

准确称取经105度烘干的磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2197g，溶于水中，转入1000毫升的容量瓶中，加水至约400毫升，加浓硫酸5毫升，用水定容，即为50ppm标准液。

测定时分别吸取此标准液0，2.5，5，7.5，10，15，20毫升于50毫升容量瓶中按待测液测定步骤显色后，即为0，2.5，5，7.5，10，15，20ppm的系列标准液。

2．钒钼酸铵试剂12.5g钼酸铵[（NH4）6Mo7O24。

4H2O]溶于200毫升水中。

另将0.625g偏钒酸铵（NH4VO3）溶于150毫升沸水中，冷却后加入125毫升浓硝酸，再冷至室温。

将钼酸铵溶液缓慢地注入偏矾酸铵溶液中，混匀，再用蒸馏水稀释至500毫升。

3．6N氢氧化钠溶液24g氢氧化钠溶于水稀释至100毫升。

4．2，6（或2，4）-二硝基酚指示剂0.25g二硝基酚溶于100毫升蒸馏水中（饱和）。

2，6-二硝基酚的变色范围PH2.4（无色）-4.0（黄色）。

变色点是PH3.1。

测定步骤：

吸取适量待测液（含P2O50.5-2毫克）20-25毫升于50毫升容量瓶中，加蒸馏水使体积约为35毫升，加2滴二硝基酚指示剂，用6N氢氧化钠和6N硝酸，中和至溶液刚成微黄色，准确加入10毫升钒钼酸铵试剂，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

放置15分钟后比色（450nm和1cm光径比色杯），同时作空白试验，进行比色，在标准曲线上查的各自ppm值。

结果计算：

P2O5%=[（A-B）*V/W]*取用量倍数*10-4

A-在标准曲线上查的的待测液ppm值；

B-空白试验查得的ppm；

V-显色时溶液体积（50毫升）；

W-样重（克）

取用量倍数-待测液总体积与测定时所取体积之比；

10-4-将ppm换算成%。

注释：

（1）此处所用钒钼酸铵试剂是硝酸系统的，适用于采用硝酸溶液制备的待测液。

如待测液是用盐酸溶液制备的，则本实验应改用下列盐酸-钒钼酸铵试剂的配方：

四、植物全钾的测定（H2SO4-H2O2消煮-火焰光度计法）

1火焰光度法：

吸取待测液5ml，移入25ml容量瓶中，用水定容。

此溶液钾离子浓度约为10-50ppm（钾）。

和钾系列标准液同时在火焰光度计上测读电流计读数。

2标准曲线：

称取0.1907克KCL（在110度烘2小时）溶于水中，定容至1升，即为100ppm钾标准液。

吸取此标准液0、1、2.5、10、20、30ml于50ml容量瓶中，加入与待测液等体积得空白消煮液后定容。

此系列标准为0、2、5、20、40、60ppm钾，在火焰光度计上测度后绘制工作曲线。

3结果计算：

K2O%=〔查得ppmK*消化液定容体积*取用量倍数〕/W*104

4式中：

ppm-根据样品测得读数后，在工作曲线上查得的ppm；

4.1.1、50-火焰光度计上测读时该溶液定容的体积（ml）；

4.1.2、取用量倍数-待测液总体积（100ml）与从中分取体积（ml）之比；

4.1.3、104-将ppm换算成%；

4.1.4、W-样品重（克）。

实验五、蔗糖、淀粉、可溶性总糖测定

0.1g干样品（过100目筛）

10ml80%乙醇

80℃水浴30min

冷却

2000rpm离心20min

残渣

10ml80%乙醇

2000rpm离心20min合并上清液

2000rpm离心20min

80℃烘干

加2ml蒸馏水

沸水浴20min，不断搅动

2ml9.2NHClO4

10min不断振荡

加水6ml

2000rpm离心25min

2ml4.6NHClO4合并上清液

10min不断振荡定容至50ml

加水6ml或100ml

过滤

（注意：

①加蒽酮试剂时，试管置于冷水浴中；

②测蔗糖用0.9ml蒸馏水+0.1ml2NNaOH+1ml0.1%间苯二酚+3ml10NHCl作参比；

③测可溶性糖用2ml蒸馏水+4ml蒽酮试剂作参比。

）

弃去

实验六、过氧化物酶、超氧化物岐化酶SOD活性及丙二醛含量的测定

一、原理

1、过氧化物酶：

在代谢中调控ZAA含量水平，免除机体内产生H2O2的毒害作用。

在过氧化氢存在下，过氧化氢酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色4-邻甲氧基苯酚。

用分光光度计测量生成物的含量。

2、SOD酶：

能消除逆境生理生成的氧自由基作用。

氮基四唑在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后能发生光化还原反应而生成蓝甲，后者在560nm处有最大光吸收；

超氧化物岐化酶能抑制氮基四唑的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。

3、MDA：

是生物膜系统脂质过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度，所以是逆境生理指标。

丙二醛在酸性环境中和高温下，发生异硫代巴比妥酸反应，形成在波长532nm具有最大光吸收的有色三甲基复合物，这复合物的克分子消光系数为1.55*105cm-1（mol/L）-1，由此，可计算丙二醛的含量。

二、试剂

0.0625mol/LPH7.8磷酸缓冲液（PBS），H2O2（PVP）聚乙烯吡咯啉酮，100mmol/L，PH7.0PBS、20mmol/L愈创木酚（现配）、0.06mmol/L核黄素、0.205mol/l蛋氨酸.0.003mmol/l乙二胺四乙酸（EDTA）.1.125mmol/L氮蓝四唑（NBT现配）.10%三氯乙酸（TCA）[含0.3%硫代巴比妥酸（TBA）]。

三、实验步骤

1、丙二醛含量测定

取叶片1g，加入10%TCA2ml和少量的石英沙，再加8mlTCA进一步的研磨，然后在4000转下离心，上清液为提取液

取上述上清液3ml（对照加3ml蒸馏水），加入3ml0.6%TBA（用10%的TCA配置）溶液，混匀于沸水上反应15min，迅速冷却后再离心。

取上清夜测定532、600、450nm波长下的消光度。

（硫代巴比妥酸要在热水中配置，如100ml：

50ml20%TCA50ml水，水沸后加TCA）

MDA含量（umol.g-1）=MDA浓度*提取液体积/鲜重

C2（umol/L）=6.45（D532-D600）-0.56D450

2、过氧化物酶活性测定取适量酶液（用PBS代替酶液作空白）加3ml反应混合液（100mmol/LpH7.0PBS，20mmol/L愈创木酚），混匀，25℃温育5分钟，加20μlh2O2启动反应于470nm波长处作时间扫描，扫描曲线斜率为酶反应速率，以每分钟O.D.470增加0.01为一个酶活单位（n），酶活性以u/mg蛋白表示。

3、超氧化物歧化酶活性的测定加入5倍于样品量的50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液[0.1mmol/LEDTA，0.3%W/VTX-100，4%W/VPVPP]研磨，在10500r/min离心20min。

在3ml反应混合液（在54ml14.5mmol/Ldl甲硫氨酸中分别加入均以50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液配置的3umol/LEDTA,2.25mmol/LNBT，和60umol/L核黄素各2ml，各个试剂用前配置、闭光）的试管中，加入适量的SOD酶液，然后放在光下照光10min，迅速测定OD560值，以不加酶液的照光管为对照。

（酶加10、20、30、40、50ul）

酶单位/样品量=反应被抑制%/[50%*3ml反应混合液中加的样品量]

实验气相色谱法测定乙烯含量

[实验原理]乙烯是植物内源激素之一，以气体形式存在，可以直接用气相色谱法测定。

所有植物组织都能产生乙烯，而准确测定乙烯释放量，对认识乙烯在植物逆境生理、发育生理、开花生理学生理过程中的作用有着重要意义。

气象色谱仪中的分离系统包括固定相和流动相。

由于固定相和流动相对各种物质的吸附能力不同，因此各种物质的分配系数（或吸附能力）不一样，当含混合物的待测样（含乙烯的混合气）进入固定相以后，不断通以流动相（通常为H2或N2），待测物不断地再分配，最后，依照分配系数大小顺序依次被分离，并进入检测系统得到检测。

检测信号的大小反映出物质含量的多少。

[实验材料]

[仪器设备及试剂]

（1）气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器）；

（2）带橡皮塞的三角瓶或真空干燥器（使用前先测量体积），100ul、1ml注射器。

（3）氮、氢及空气钢瓶。

（4）标准乙烯。

[实验步骤]

（1）材料处理。

将试验材料称重后装入密封容器中，置于室温（25℃）下1-2h。

（2）测定条件。

柱温为80℃，气化室温度为120℃，以氮气为载气，流速为50ml/min，空气流速为500ml/min，氢气流速为60ml/min。

（3）配制一定浓度的标准乙烯气体。

（4）用注射器抽取1ml气样，测定乙烯峰高度。

取标准乙烯气体，测定峰高值。

[结果计算]

气样中乙烯的浓度=样品峰高*标样的浓度（μl/L）/标准乙烯峰高

乙烯生成速率=乙烯浓度*容器体积/密封时间*样品重量[μl/（g.h）]

实验α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的测定

[实验原理]

α-淀粉酶能将淀粉分子的α-1，4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。

β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末端分解2个葡萄糖单位的α-1，4糖苷键生成麦芽糖，因此可用DNS法测定溶液中还原糖的含量。

发芽的水稻种子。

[仪器设备]

分光光度计，恒温水浴锅。

1，粗酶液制备

取新鲜植物材料10g，洗净