微生物学实验Word文档格式.docx

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1、请大家翻到实习指导首页，请哪位同学读一下。

2、下面再强调两点：

A、我们实验的一个重要特点，是其主要材料为病原体（如TB、伤寒、HbsAg痢疾）即同学们在实验过程中要接触到病原微生物，为了避免污染和防止感染，应严格遵守实验室规则，还必须树立无菌观念：

一方面要保护自己要防止病原体感染人体，必须做到①必须穿白大衣进实验室②实验室内禁止吸烟、吃东西（很多微生物通过消化道传染）③桌面、衣物等污染，应立即用消毒剂处理（倾倒适量2-3%来苏尔或0.1%新洁尔或84消毒液于污染面，浸泡半小时后抹去，某些细菌抵抗务强，应浸泡更长时间。

紫外灯杀菌作用强但穿透力弱，要双面照，只用于物品表面及空气的消毒。

）④离室时用肥皂或84液洗手。

另一方面：

避免环境中的微生物污染试验标本：

应严格无菌操作，除按规定步骤操作以外，还必须做到实验时关好门窗，以减小空气流动。

无菌技术的好坏直接影响实验结果。

B、另一特点是大部分实验当天看不到结果，两次才能完成，因此要将自己的实验物品标记清楚：

姓名、名称、时间等。

用过的器材放至指定地点，不能乱扔，菌液不能倒入水池，指出污染器材存放点。

细菌的人工培养法

1、了解培养基的种类与用途

2、掌握细菌接种技术

1、培养基

2、接种技术

三、培养基

（一）定义：

培养基是由适合于细菌需要的各种营养物质配制而成的营养基质，可供细菌在其中生长繁殖。

培养基的基本成分有蛋白胨、氨基酸、糖类、盐和水分。

任何培养基除含有必需的营养物质外，还必须有一定的酸碱度（PH7.4-7.6）,澄清并保证无菌。

（二）主要用途：

1、分离并繁殖细菌；

2、保存菌种；

3、鉴定细菌；

4、生产菌苗、抗菌素以及细菌生理学的研究。

（三）分类

1、按用途分

基础培养基：

含有多数细菌所需的基本营养成分，最常用为肉浸液（新鲜牛肉浸出液+蛋白胨+NaCl+磷酸盐）肉膏汤、蛋白胨水

营养培养基：

在基础培养基中添加一些其他营养物质，如葡萄糖、血液、血清等，可供营养成要求较高的细菌生长，如最常用的血琼脂平板。

鉴别培养基：

利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的低物，观察细菌生长后对低物的作用情况，从而鉴别细菌。

例如在无糖的基础培养基（蛋白胨水）中加入乳糖和指示剂，接种细菌培养。

若该菌能发酵乳糖产酸，指示剂变色，不发酵乳糖则颜色不变，常用的糖发酵管，葡萄糖蛋白胨水等。

选择培养基：

在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某些细菌生长，而有利于另外一些细菌生长，从而将后者从混杂的标本中分离出来。

如SS培养基（基中含有的胆酸盐能抑制G+菌，枸椽酸钠和煌缘能抑制大肠肝菌，使致病的沙门菌和志贺菌容易分离得）在培基加入抗生素，也可起选择作用。

厌氧培养基：

专性厌氧菌需在无游离氧环境下才能生长。

一种方法是将普通培养基放在无氧环境中培养；

另外一种是在培养基中加入还原剂以降低培养的氧化还原电势，并在培养基表面用凡士林或石蜡等封住，与空气隔绝，使培养基本身成为无氧环境，常用有庖肉培养基；

加入肉渣，其中含有不饱和脂肪酸和谷胱甘肽，具有还原性。

2、按物理状态分

液体培养基：

用于大量繁殖细菌（增菌）

半固体培养基：

在液体培养基中加入0.2-0.5%的琼脂（agar）而成，用于观察细菌动务和保存菌种。

固体培养基：

在液体培养基中加入2-3%的琼脂而成，用于细菌分离和纯化。

四、接种

一般被检标本中如（脓、尿、痰、粪）常含有多种细菌。

因此，首先必须反它们各个分离开

来，获取得纯种，然后方能进一步鉴定。

所谓纯种，即可含有一种细菌的菌种，要获得纯种，必须进行分纯培养，何谓纯培养？

怎样获得纯培养？

把两种或两种以上的细菌分离开来，得到单一菌种的培养技术，称为纯培养。

获得纯培养最简单有效的方法是在固体培养基上划线分离法。

细菌通过划线接种子固体培养表面，由于划线的分散作用，使许多混杂的细菌在培养基表面上散开，经一定时间培育后，繁殖而成的，挑出一个菌落移种至另一培养基中，所生长出来的细菌为纯种。

（一）平板划线接种法（示范）

1、每人拿一平皿，在平皿底部标记好姓名、日期、学号，并在琼脂下板一侧边缘画一条标记，即作茧自缚原划线。

2、点燃酒精灯，右手拿接种环，烧灼灭菌冷却后，取待检标本少许。

3、左手斜持（45O角）琼脂平板，略开盖，平板在酒精灯火焰左前上方约5-6㎝距离。

右手持已取标本的接种环在记号笔已作的原划线处划一下。

4、烧灼接种环冷却后划线未端沾取少许标本（也可在原划线上经过一下），使接种环与平板表面成30-40度角，运用腕力用接种环在平板上来回划线（划线要密，细但不能重叠，不要划破琼脂表面，体会培基硬度一似豆腐）充分得用平板的面积，划满整个平皿，可一次划完，也可以分区划。

注意无菌技术，避免空气中细菌的污染。

5、接种环烧灼灭菌后方可放下。

平皿倒置，送温箱培养24小时后观察。

6、几个注意

①继划线不能与原划线脱节，要划得密而不重叠，要划满整个平皿，不要划破琼脂。

②上盖水平，下盖倾斜（上下开启）

③接种环与平板夹角30-45O

④烧灼灭菌时应如图所示先烧干接种环，因为接种环可能有残留的蛋白质，如果直接烧灼，表面的蛋白质马上变性后形成包裹，内部仍有细菌存活，受热的蛋白质包裹物膨胀破裂，活菌迸出，污染空气。

（二）液体培养基接种法

1、左手握含菌之甲管与液体培养基之乙管下端，管口平齐，甲管在外，乙管在内，右手持接种环并以无名指与小指挟位甲管之棉塞，小指与手掌挟位乙管之棉塞，在火焰旁拔开，并将管口通过火焰。

2、将烧灼过的接种环插入甲管，待冷却后，取菌液一环，立即移入乙管，在接近液面的管壁上轻轻研磨，然后将试管稍倾斜，并沾取少许肉汤调和，使菌混合于肉汤中。

3、管口通过火焰，塞上棉塞。

接种环须烧灼灭菌后方可放下。

（三）半固体培养基接种法

1、用上法握好含菌之甲管及半固体培养基之乙管。

2、将烧灼过接种针插入甲管，待冷后，沾取菌液，立即移入乙管垂直刺入半固体培养基的中心至近管底处，但不可直剌至管底，然后循原路退出。

2、管口通过火焰，塞上棉塞。

接种针须烧灼灭菌后方可放下。

（四）标本鉴定程序

生化反应鉴定血清分型

标本接种（划线分离）菌落药敏试验噬菌体分型基因组

毒力（体内、体外）基因型分型G+C

形态学检查PCR

烧灼接种环：

先垂直烧灼，烧红以后再慢慢斜烧，一直烧到接种环的柄下部。

酒精灯火焰四周10㎝为相对无菌区。

细菌形态与结构的观察

了解细菌形态与结构

1、细菌基本形态的观察

2、细菌基本结构的染色和观察

3、细菌特殊结构的观察

一、细菌基本形态的观察

1、球菌：

葡萄球菌G+球形，常呈葡萄串状排列

2、杆菌：

大肠杆菌G－为两端钝圆的短杆菌，散在排列

3、螺形菌

弧菌：

霍乱弧菌G－菌体只有一个弯曲，逗点状，散在排列

螺菌：

两个弧以上

看片时注意：

形态、排列、染色性

二、细菌基本结构的染色和观察

1、细胞壁：

蜡样杆菌培养物常规涂片5%鞣酸染30-60分钟0.5%结晶紫染2分钟0.5刚果红脱色

细胞壁为紫红色

2、核质：

蜡样杆菌培养物常规涂片甲醇固定60℃HCl（IN）水解10分钟姬姆萨染色液2-3d加入1mlPH7.0的新鲜双蒸水中，用此液染30分钟。

胞浆呈浅紫红色，核质呈深紫色（拟核、无核膜、核仁）

因细菌胞浆内含大量的RNA，用碱性染料染色时着色很深，将核质掩盖，用盐酸或RNA酶处理，使RNA水解，再用姬姆萨氏或突尔根氏染色液，即可染出核质。

3、异染颗粒：

白喉杆菌，美蓝染色2-3分钟

白喉杆菌菌体呈浅兰色，异染颗粒呈深蓝色

三、细菌特殊结构的观察

1、鞭毛：

变形杆菌菌体呈紫红色，周身鞭毛呈红色

2、荚膜：

肺炎球菌为G+球菌，成双排列，菌体周围有一未着色空圈，即为荚膜。

3、芽胞：

破伤风杆菌为G+杆菌，菌体顶端可风一圆形未着色空泡，即为芽胞。

4、菌毛：

电镜下才能观察到

四、小结

（一）细胞壁功能与医学意义：

1、功能：

细胞壁坚韧而且富弹性，能维持菌体固有的形态并保护细菌抵抗低渗环境；

细胞壁上有许多小孔，参与菌体内外的物质交换；

菌体表面带有多种抗原表位，可以诱发机体的免疫应答。

2、医学意义：

与致病性有关；

与革兰染色有关；

与细菌对药物的敏感有关。

（二）细菌核质特点

1、原核、无核膜、无核仁；

2、由单一密闭环状DNA分子反复旋卷曲盘绕组成松散网状结构，不含组蛋白；

3、其功能与真核细胞的染色相似，带有细菌生命活动所必需的各种遗传信息、控制细菌生长、繁殖与代谢。

（三）异染颗粒

1、成分：

RNA和多偏磷酸盐，贮有养料和能量；

2、特点：

嗜碱性强，美兰染色着色深，用特殊染色法可以染成与菌体其他部位不同的颜色；

3、意义：

鉴别细菌，在白喉杆菌内最明显，而且且比较稳定。

（四）荚膜（结合大课，提问）

1、结构特点：

细胞壁外包绕一层粘液物质，厚度≥0.2um不易着色。

G染色、墨汁染色，菌体周围未着色的透明圈。

荚膜染色可着色。

2、化学组成：

多数由多糖组成，少数由多肽组成；

3、形成条件：

营养丰富（机体内、营养丰富的培基中）

4、医学意义：

与毒草力有关，抗吞噬，粘附作用，抗有害物质的损伤

与分型有关

（五）芽胞（spore）

1、结构特点：

大小形态，位置随菌种不同而不同，壁厚而致密不易着色，普遍染色为未着色的透明小体；

2、形成条件：

营养不良营养适宜

细菌芽胞繁殖体

体外体内

芽胞不是细菌的繁殖方式，而且是细菌的休眠状态，可以帮助细菌度过不良环境；

3、化学组成：

芽胞带有完整的核质，酶系统和合成菌体组分的结构，能保存细菌的全部生命必需物质。

4、芽胞抵抗力强的原因：

含水量少，蛋白质受热后不易变性；

具有多层致密厚膜，理化因素不易透入；

含吡啶二羧酸（DPA），DPA与钙结合生成的盐能提高芽胞中各种酶的热稳定性。

5、医学意义

灭菌是否彻底的指标；

芽胞发芽形成菌体是某些传染病的重要传染源；

鉴别细菌。

（六）鞭毛

附着在菌体外的细长并呈波状弯曲的丝状物，鞭毛染色可见；

鞭毛Pr；

3、分类：

根据鞭毛的数量和部位，将鞭毛菌分成四类：

单毛菌（霍乱弧菌）、双毛菌（空肠弯曲菌）、丛毛菌（铜绿假单胞菌）、周毛菌（伤寒沙门菌）

4、医学意义：

是细菌的运动器官，根据动力可鉴定细菌，动力与致病性有关；

具有免疫原性，可用于血清学分型与诊断。

（七）菌毛

G－多见，菌体外极纤细的丝状物，比鞭毛更细，更短而且直硬与细菌的运动无关，普通光镜下看不到，必须用电镜。

菌毛蛋白

普通菌毛：

数目多，广泛存在于肠道菌中

功能：

粘附作用，强粘附干乳胶，RBC和粘膜上皮细胞表面，与细菌的致病性有关

性菌毛：

数目少，只有1-4根比普通菌毛长而粗，不仅见于少数G－菌

可传递质粒，是某些噬菌体吸附于细菌的受体

问题：

1、细胞壁功能及医学意义？

2、核质、异染颗粒的镜下特点？

3、荚膜形成条件及医学意义？

4、芽胞形成条件，抵抗力强的原因及医学意义？

5、鞭毛的分类及医学意义？

观察上次分纯结果：

有无菌落；

有无单个菌落：

一个细菌二分裂繁殖成的集团

怎样区别接种菌落和污染菌落：

是否在划线上，继划线与原划线是否有相同性状

观察菌落：

大小：

>

3㎜大菌落<

2㎜小菌落2-3㎜中菌落

颜色

光滑/粗糙

有无溶血

凸起/凹陷

油镜的使用：

细菌体积微小，肉眼看不见，必须通过显微镜的放在才能看见，而且细菌一定要用油镜观察，即要放大1000倍才能看清楚，有关油镜的使用，同学们在学习寄生虫时应该已经接触过，今天我们再复习一下。

先用低倍镜找到目标，换高倍镜调微调确定目标，换油镜，先在玻片上加一滴油，然后油镜头浸入油内，目标是减少光线的散射，因为油镜的透镜很小，从玻片透过的光线通过空气时，因介质密度不同，会发生散射现象，使射入镜筒的光线很小，物象不清。

若在油镜与玻片中间加入柏油（玻璃1.52与香柏油折光率相近1.515）空气1.0则光线不发生散射，因此能清楚地看到物象。

油镜用完后一定要用二甲苯将镜头上的油退掉，然后用擦镜纸擦干，将物镜转成“八”字形，使之不正对光线，降下聚光器，送入镜箱。

观察细菌的方法：

直接镜检：

观察生活状态下细菌的形态及运动情况，有悬滴法和压滴法。

简单染色法美兰

（只有一种染料）复红

染色镜检：

＋

GramStain

鉴别染色法（两种或两种以上染料）－

抗酸

特殊

革兰染色法

1、了解GramStain的原理

2、掌握GramStain的技术

1、GramStain的原理

2、GramStain的操作步骤

3、影响因素

三、GramStain的原理（请大家回忆一下大课讲的内容）

GramStain的原理尚未完全阐明，目前存在三种解释：

1、G+性菌的细胞壁结构致密〖〗，肽聚糖层厚，外膜脂质少，致密的三维空间结构，乙醇使细胞壁脱水，形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。

G－性菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，外膜脂质多，二维空间结构，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，胞内结晶紫—碘复合物被乙醇析出而且脱色。

（通透性学说）

2、G+性菌的等电点（PI2-3）较与G－性菌（PI4-5）低，在相同PH下（人体内为7.4，培养基中为7.2-7.6），G+性菌所带负电荷比G－性菌多，故G+性菌与带正电荷的结晶紫结合牢固，不易被乙醇脱去。

（等电点学说）

3、G+性菌胞内含较多的核糖核酸镁盐，与结晶紫—碘复合物结合成大分子复合物，不易被子乙醇解析出；

G－性菌含镁盐较多，与结晶紫—碘复合物结合不牢固，易被乙醇脱去。

（化学学说）

以上三种解释，以第一种最为重要。

四、操作步骤

GramStain分两大步：

涂片制作、染色

（一）涂片制作：

分三步——涂片、干燥、固定

1、涂片：

取清洁无油载玻片一块，于火焰上通过几次（去油）

若标本为菌液，则将灭菌后的接种环，取菌液1-2环，均匀涂布成1.5㎝的菌膜。

将接种环烧红灭菌，放回原处。

若标本为菌落，则取生理盐水1-2环于载玻片中央，灭菌后，取菌落少许，均匀涂成1.5㎝的菌膜，将接种环烧红灭菌，放回原处。

2、干燥：

用电吹风吹干，或于室温下自然干燥；

或于火焰1.5㎝高处烘干。

3、固定：

将载玻片有标本一面朝上，快速成通过火焰3次，温度不宜过高，以触及皮肤感受热不感烫为宜。

这样可以使菌体与玻片粘附更牢固。

温度过低，不易固定。

（二）染色：

分四步——初染、媒染、脱色、复染

1、初染：

滴结晶紫液1-2滴，染色1分钟后倾斜载玻片，用自来水轻轻冲洗（水流小一点），再将玻片上积水甩干。

2、媒染：

滴碘液（卢戈氏液）1-2滴，染色1分钟后水洗，甩干。

3、脱色：

滴95%乙醇2-3滴，涂片轻轻晃动，使其脱色，通常需30秒左右（脱色时间之长短须依所作涂片之厚薄而定）水洗，甩干。

4、复染：

滴石炭酸复红稀释液1-2滴复染1分钟，水洗，甩干。

五、影响因素：

不含镁盐，G+变为G－（GramStain与菌体含镁盐多少有关）

1、培养基

PH值（GramStain与菌胞壁等电点相关）G－变为G+（PH值升高，G－带负电上升）

2、细菌：

菌龄在衰亡期的细菌，G+变为G－

胞壁完整性：

L型细菌，G+变为G－

3、操作技术：

脱色时间的长短，涂片厚薄，染色液不合格，顺颠倒均可使G+与G－互变。

涂片厚，菌龄短，则乙醇脱色时间可延长。

注意：

菌落挑得不必太多，半个菌落，仔细涂匀即可。

4、提问：

有两种菌，一种原为G+，另一种为G－，若都染色红色或蓝色紫色，这肯定有问题。

倘若问题出在脱色环节，请问如何解释？

若都为红色，则脱色时间太长，G+性菌的胞壁亦被破坏；

若都为蓝紫色，则脱色时间太短，G－性菌的胞壁来不及被破坏

5、强调：

GramStain的关键在于乙醇脱色时间的长短，一般在20-30秒。

6、染色液的影响：

结晶紫水份挥发，易使G－变为G+；

碘挥发，易使G+变为G－。

六、医学意义

1、将细菌分为两大类——G+和G－

2、了解细菌

G+外毒素

致病性

G－内毒素

药敏性G+对青霉素敏感

报告：

G染色结果，绘图，简单描述并讨论其成败关键。

原理：

1、G+菌PI（2-3）比G－菌PI（4-5），G+菌带负电多，结合碱性染料（正电）能力强；

2、G+菌菌体内，含有核糖核酸镁盐，与结晶紫—碘结合成牢固复合物不易脱色；

3、G－菌细胞壁为脂类，且通透性高，酒精（脂溶剂）易进入G－菌内脱色。

成败关键盘：

涂片厚薄、脱色时间

意义：

将细菌分为G+、G－菌

为临床选用抗生素提供依据

了解细菌的致病性

血浆凝固酶试验P196

了解血浆凝固酶试验的意义

1、血浆凝固酶

2、操作步骤

3、注意事项

三、血浆凝固酶

（一）定义：

是能够使含有枸橼钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。

由致病性葡萄球菌产生。

（二）分类：

1、游离凝固酶：

分泌至菌体外的蛋白质，作用类似凝血酶原物质，被人或兔血浆中的协同因子激活为凝血样物质后，使液态的纤维蛋白原变成固态的纤维蛋白，从而血浆凝固。

用试管法检测。

2、结合凝固酶：

结合于菌体表面并不释放，其作用是在该菌株的表面有纤维蛋折原受体，当菌混悬于人或兔血浆时，纤维蛋白原与菌受体交联而且使细菌凝集。

用玻片法测定。

两种凝固酶互不相同，但呈平行分布，达90%以上。

（三）医学意义：

血浆凝固酶是葡萄球菌的毒力因子。

请同学们思考一下为什么？

凝固酶阳性株进入机体后，1、结合凝固酶使周围血液血浆中的纤维蛋白等沉积于菌体表面，阻碍体内吞噬细胞的吞噬；

即使被吞，也不易被杀死。

2、游离凝固酶集聚在细菌四周，亦能保护病菌不受血清中杀菌物质的破坏，纤维蛋白凝集在周边，使感染局限化，形成脓肿、血栓。

但近年来，临床上分离出越来越多的凝固酶阳性的致病菌，因此我们认为凝固酶试验阳性株一定是致病株，但阴性者也要警惕，防止放过了阴性致病株。

四、操作

（一）玻片法：

1、取干净玻片一块，用标记笔分为两格，一格加生理盐水2环，另一格加1∶2的人（或兔）血浆1环。

2、用烧红灭菌的接种环取葡萄球菌落少许在生理盐水中磨匀，然后取此混悬液一环与血浆混匀。

3、5分钟以内观察结果。

若有大片凝块出现，即为阳性，若无凝块出现，即为阴性。

（注意生理盐水侧对照）

（二）试管法：

请同学们自己看实习指导，强调一点，当玻片法阴性，或需进一眇证实时，我们用试管法，因为试管法可靠性更高。

五、注意事项

1、不要把生理盐水侧与血浆侧混在一起。

2、为什么要做生理盐水对照？

因为粗糙型菌落可自凝，所以作生理盐水对照加以排除。

若生理盐水侧有凝块，则挑光滑菌落重做。

3、用人血浆时玻片可能出现假阳性，由于某些人产生葡萄球菌特异性凝集抗体使菌体凝集。

我们可用试管法，或改用兔血浆进行实验。

4、有器材试剂不含热原质。

玻璃器材：

160℃-180℃，2—4小时；

250℃，1小时

噬菌体特异性实验

了解噬菌体的特性

1、噬菌体的特性

2、实验操作

三、噬菌体毒性温和

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。

（二）特性：

1、结构简单，形体很微小，能通过滤菌器。

2、分布广泛，只要有细菌存在，就可能存在噬菌体。

3、化学组成为核酸与蛋白质，抵抗力较一般细菌繁殖体强，有抗原性，但抗体对对细胞内的噬菌体无效。

4、严格的细胞内寄生，只能在活细胞内生复制。

5、严格的宿主特异性，一种噬菌体只感染一种，甚至一种型别的细菌。

6、溶菌作用，毒性phage与进入溶菌周期的温和phage能裂解细菌。

四、实验

（一）痢疾杆菌噬菌体特异性试验

将普通培养基分为两部分，分别用无菌棉签涂满大肠杆菌和痢疾杆菌（注意不留空隙）等菌液干后，用灭菌的接种环，取痢疾杆菌噬菌体一环，点种于大肠杆菌的一侧的中心；

然后烧灼接种环，冷却后再取环点种于痢疾杆菌的一侧的中心，然后37℃温室中培养24小时，观察结果。

在一侧的中心眯种痢疾杆菌phage

痢疾

大肠痢疾37℃24小时大肠

溶菌斑（出现在哪一侧？

）

（二）金黄色葡萄球菌噬菌特异性试验

将普通培养基分为四部分，分别涂满金葡53C株、1800株、Cowan1株及表葡（注意不要重叠），分别在四个部分的中心，点种金葡53C株噬菌各一环。

在37℃温室中培养24小时，观察结果。

（三）液体培养基中的噬菌现象

在含幼龄（4-6小时）细菌的培养基内加入相应菌的噬菌体，在37℃下反应30-60分钟，观察结果。

（四）注意：

1、涂菌时不留空隙，但不能太多，避免菌液流动（取菌后，棉杆在管壁内稍挤压一下），若用接种，则不分原划线，继划线，不留空隙。

2、接种环注意烧灼来菌。

（五）结果判定

1、在痢疾杆菌侧出现透明空斑，在大肠杆菌侧无空斑。

因为痢疾杆菌噬菌体有种特异性，不感染大肠杆菌，而只感染，裂解痢疾杆菌，所以痢疾杆菌侧出现空斑。

2、在金葡53C株出现透明空斑，在其它三型无空斑。

因为金葡53C株噬菌体特殊性更高，仅附着于金葡53C株的位点，所以出现上述结果。

3、液体培养基由混浊变为澄清。

因为加入噬菌全后，细菌不断地被感染，裂解而且被消亡，裂解物相互交联，沉淀下来，所以液体培养基变澄清。