分生作业汇总Word文档格式.docx

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因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。

12.巢式PCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

13.Real-timePCR

Real-TimePCR技术，又称实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。

常用：

SYBRgreen（荧光染料法）和Taqmanprobe（探针法）。

14.变性

指在某些理化因素的作用下，维系核算二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程。

核算的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部，但核酸变性不涉及核酸分子一级结构的变化。

引起核算变性的因素有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等。

其中加热使DNA变性是实验室最常用的方法。

15.复性

指的是变性核酸在适合条件下，两条互补链全部或部分恢复到双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。

DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm值低25~30℃时，即可复性，该过程通常称为退火。

16.退火

DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm值低25~30℃时，即可复性，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链，该过程通常称为退火。

简答题

1.简述真核生物基因组的结构与功能特点。

答：

1、基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内基因组是双份的（即双倍体，diploid），有两份同源的基因组。

2、基因转录产物为单顺反子。

一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链。

3、存在重复序列，重复次数可达百万次以上。

4、基因组中不编码的区域多于编码的区域。

5、大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，splitgene）

6、基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小。

2.试述双向凝胶电泳技术的基本原理。

1、第一向进行等点聚焦，在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。

2、第二向在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。

SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；

还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。

蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异，沿垂直方向进行相对分子质量的分离。

蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质的分子量大小。

3.分子克隆技术包括哪些基本步骤？

1、目的基因的获取；

2、载体的选择；

3、目的基因与载体连接；

4、重组DNA导入受体细胞；

5、重组体的筛选。

4.目的基因和载体连接主要有哪些方法？

1、黏性末端连接；

2、平末端连接：

1）质粒和目的基因上没有相同的酶切位点，可用生成平末端的限制酶切割质粒和目的基因生成平末端，再用连接酶连接二者；

2）人工接头连接；

3、通过同聚尾连接。

5.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。

1、限制性核酸内切酶：

简称限制酶，是一类能识别双链DNA特异的48个碱基对和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。

功能：

能识别双链DNA特异的4~8个碱基对，并在此序列内根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。

2、DNA聚合酶：

1）DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是单一多肽链的多功能酶，分子量为103kD，它具有3种酶活性：

①5→3DNA聚合酶活性；

②3→5核酸外切酶活性；

③5→3核酸外切酶活性，常用其水解的Klenow片段。

1.补齐双链DNA的3’末端，同时可使3’末端DNA标记同位素，

2.在cDNA克隆中，合成cDNA的第二链，3.DNA序列分析。

2）TaqDNA聚合酶，是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5→3聚合酶活性和依赖于聚合作用的5→3外切酶活性。

作用：

用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

3）反转录酶，是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA。

1.反转录作用，以单链RNA为模板，沿5’→3’方向合成DNA，催化合成RNA：

DNA（cDNA）杂交链，2.核酸酶H的水解作用，沿3’→5’方向特异地水解RNA：

DNA杂交链中的RNA链，3.依赖DNA的DNA聚合酶作用：

以杂交链中的单链cDNA为模板，催化合成cDNA的互补链。

4）末端脱氧核苷酰转移酶，分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。

功能1.在载体或目的基因3’末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接，2.用于DNA3’末端的同位素探针标记。

3、DNA连接酶：

称为基因工程的缝纫针，DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。

催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5’磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来。

4、碱性磷酸酶：

能催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团。

1.除去DNA片段上的5磷酸，以防自身连接；

2.在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5端的磷酸。

5、T4多核苷酸激酶：

1.能够催化磷酸在g-位和双链/单链DNA或RNA的5'

-羟基末端以及3'

-单磷酸核苷间进行转移和交换。

2.该酶还具有3'

磷酸酶活性，将3'

-磷酸基团从寡核苷酸的3'

磷酸末端、脱氧3'

-单磷酸核苷和脱氧3'

-二磷酸核苷上水解掉。

6、核酸酶S1：

可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。

1.除去粘性末端以产生平末端。

2.除去cDNA合成时形成的发夹结构。

3.分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。

6.举例说明载体应具备的基本要素。

应具备基本要素：

1、能自我复制并具较高的拷贝数。

2、分子量一般<

10Kb。

3、带有遗传筛选标记。

4、有适当的限制酶酶切位点，便于外源DNA的插入和筛选。

书中以pBR322质粒为例，pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。

它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。

在这两个抗性基因中分别含有BamHI和PstI等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。

如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。

7.简述双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。

双抗生素筛选：

某些质粒载体如pBR322质粒中有Ampr和Tetr抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列时，则此质粒由Tetr变为对四环素敏感（Tets）。

这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。

在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体。

蓝白斑筛选：

某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内-互补，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。

当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法。

8.有哪些常用的探针标记物？

放射性同位素标记：

常用标记探针的同位素有32P标记的各种核苷三磷酸、3H标记的氨基酸或核苷酸、35S标记的氨基酸（最常用的是蛋氨酸）及其取代核苷三磷酸的α位磷酸基中的氧、125I标记的碘化钠溶液等；

非放射性标记物：

常用标记物有酶标记（辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶）、荧光素标记（FITC；

TRITC；

四乙基罗丹明（RB200）；

花青类染料）、生物素标记、光敏生物素标记、地高辛标记等。

9.如何进行探针的标记？

一、放射性同位素标记法：

放射性同位素标记物：

32P、35S、3H、125I等。

同位素标记探针的方法：

缺口平移法（双链）：

该方法为双链DNA分子在适量的DNaseⅠ和Mg2+的存在下，被随机切开若干个缺口，缺口处形成3’-OH末端，此时再在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以同位素标记的dNTP为原料在缺口游离的3’-OH末端逐个加入dNTP。

同时大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ发挥5’-3’核酸外切酶活性，将缺口5’端核苷酸逐个切除。

其结果是在3’端依次添加标记的核苷酸，使缺口沿5’-3’方向移动，此即缺口平移法标记探针。

随机引物法（单链）：

以单链DNA为例，将寡核苷酸片段与已变性的DNA模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，然后向反应体系加入已标记dNTP和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，以寡核苷酸为引物的3’-OH端为开端沿5’-3’方向、按照碱基互补原则，合成一条与模板核苷酸完全互补的新的DNA链。

经变性后，新合成探针片段与模板解离，可得到无数各种大小、已标记的探针DNA。

此外，还有DNA探针的末端标记，PCR标记DNA探针，同位素标记RNA探针等方法。

二、非放射性标记物有辣根过氧化物酶、荧光素、生物素、光敏生物素、地高辛等。

标记方法有化学修饰标记法和酶促反应标记法。

化学修饰标记法是利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的某些基团发生化学反应，将标记物直接或间接结合到探针分子上。

酶促反应法是将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到核酸探针分子中。

10.影响核酸分子杂交的因素有那些？

如何进行杂交条件的优化？

影响核酸分子杂交的因素：

1、核酸分子的浓度与长度；

2、温度；

3、离子强度；

4、变性剂（甲酰胺）；

5、核酸分子的复杂性；

6、非特异性杂交反应。

优化杂交的条件也是影响核酸分子杂交的因素。

杂交条件的优化：

1、探针的选择，1）检测单个碱基改变选用寡核苷酸探针。

2）检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。

3）长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体。

4）100bp左右的探针适合原位杂交。

2、探针的标记方法，1）在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。

2）在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等。

3、探针的浓度，1）随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。

2）膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml。

3）原位杂交中，一般各种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。

4、杂交的最适温度，1）若反应温度低于Tm10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。

2）一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行。

5、杂交反应时间，杂交时间短了，反应无法完成；

长了引起非特异结合增多。

一般杂交20h左右。

6、洗膜温度，杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5~12℃进行。

7、杂交液的选择，在使用杂交液必要时加一些杂交促进剂，常用的有硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸。

11.根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？

主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选择有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。

如电荷性质的差异用离子交换层析法、电泳法；

分子大小形状差异用凝胶过滤法、超滤法、透析法、离心法；

溶解度差异用沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀）、分配层析、萃取、结晶。

12.什么原因易引起DNA降解，该如何解决？

原因：

a材料不新鲜或反复冻融b未很好抑制内源核酸酶的活性c提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断d外源核酸酶污染e反复冻融解决：

a尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融b液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液c在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量d细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔e所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌f将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

13.简述PCR技术的基本原理及其反应体系的一般组成？

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。

PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。

需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。

DNA模板变性：

模板双链DNA单链DNA，94℃。

退火：

引物＋单链DNA杂交链，引物的Tm值。

引物的延伸：

温度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。

新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。

反应体系：

模板DNA、四种dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、引物1、引物2、TaqDNA聚合酶、缓冲液及镁离子。

14.试分析PCR出现非特异性扩增产物的原因及解决方法？

造成PCR非特异性产物的常见原因及其预防措施有：

①引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降解引物用量;

②TaqDNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶;

③镁离子浓度过高，可适当调节镁离子浓度;

④退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增;

⑤热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。

15.简述代谢组学特点？

1）.关注于内源性小分子化合物。

2）.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究

3）.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。

4）.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。

1）.miRNA基因被转录成pri-miRNA（RNA聚合酶Ⅱ）；

2）.pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷酸的pre-miRNA（Drosha,DGCR8）；

3）.pre-miRNA从核内被转移至胞质（Exportin-5,Ran-GTP）；

4）.pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链RNA双体（Dicer,TRBP,PACT）；

5）.双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。

17.简述miRNA功能研究方法？

1）miRNA体外或体内水平的过表达研究：

构建相应的表达载体、体外合成miRNA前体分子；

2）miRNA表达抑制研究：

基因水平抑制miRNA表达、使用反义核酸分子抑制miRNA表达。

4.MicroRNA引发肿瘤的可能原因？

1）microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的；

2）许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域；

3）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控。

18.简述基因治疗的必备条件。

1）分子缺陷清楚；

2）可以得到相应基因的克隆；

3）病理生理机制已知；

4）有利的风险-利益比；

5）治疗基因可以被调控；

6）合适的靶细胞；

7）有效安全；

8）相关法规健全。

19.简述骨髓干细胞的特性。

1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗；

2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身受益；

3）外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身；

4）造血干/祖细胞的功能活性可在体内外进行分析；

5）取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存活，临床已有成熟技术。

20.简述基因治疗有待解决的问题。

1）难以获得真正有治疗作用的基因；

2）外源基因的表达难以在体内精确调控；

3）体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变；

4）过多的外源蛋白对机体带来可能的影响；

5）随机整合潜在的威胁。

文献1、

埃博拉病毒疫情的起源：

是因为十三位女性，在参加了在几内亚举行的一位曾经诊治过患埃博拉病毒病的患者的乡村医生的葬礼后，而感染了埃博拉病毒，随后四处传播，演变成现在埃博拉病毒大爆发的状况。

埃博拉病毒传播模式：

根据标本的病毒基因的相似性来推断，最初病毒是由自然宿主传播至人所引起感染，在暴发流行期间，存在广泛地人与人之间的传播。

与以往的埃博拉病毒大爆发有所不同，就这次的病毒基因测序结果显示，地方的流行性并不会随着人类和病毒的自然宿主的接触次数增多而增长。

文献2、

1.简述这种新的构建点突变方法的原理及过程

原理：

使用野生型模板DNA的再退火温度作为变性温度。

在这个温度下，野生型NDA模板不能完全地变性。

这种新的方法被成功地建立是基于一个假设：

在PCR期间，当两种类型的模板（也就是说双链和单链）共存在反应体系中，双链模板（也就是说野生型模板）在在退火温度下将不会被扩增。

在一个PCR反应中，所有的引物（也就是说一种携带突变基因的引物和两种侧翼引物）能够被同时加入和持续地使用，且无任何干扰。

过程：

第一步：

在较高的退火温度（72℃）下，能允许携带突变位点的引物去结合模板DNA（smDNA），而此时普通引物由于所需退火温度低而被限制。

此时合成出带有突变位点的较长的单链。

第二步：

在较低的变性（比如模板再退火温度）和退火温度（通常36℃~46℃），能允许一条侧链引物（如F2）去结合，生成完整的带有突变位点的较长双链。

而此时野生型模板DNA没有被扩增。

第三步：

通过上述两步产生的带有突变位点的较长双链，在第一步的条件下解开变为单链，以此单链为引物，在较高的退火温度（72℃）下与模板DNA结合，此时可以合成出，带有目的突变位点的完全的单链DNA模板。

随后，重复第二步，使用另一个引物（如R1）结合该单链，即可得到目的突变DNA双链。

随后：

通过琼脂糖凝胶电泳验证目的突变DNA片段是否扩增成功。

引物：

1种带有突变位点的引物（所需退火温度高），2种普通引物（所需退火温度低）

因为引物所需要的退火温度不同，以上引物可同时被加入单一持续的反应管中。

2.举出另一种构建点突变体的方法

KeandMadison大引物改良法：

由于创新的引物设计，它不要求后续轮的PCR之间的DNA的纯化。

但是，这种方法也不能完全自动化，因为在完成第一次PCR步骤后，高的Tm侧翼引物必须被加入到反应管中，随着大引物用于第二PCR步骤。

此外，通常需要选择6菌落进行DNA测序，以验证所需突变。

文献3本文中采用了那些技术方法进行糖组学的研究？

1）凝集素荧光标记

2）HPLCanalysis高