银杏叶提取物的生理活性及质量控制方法Word格式.docx

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5.1.3胶束电动毛细管电泳（MECC）法5

5.1.4核磁共振（NMR）法5

5.2银杏内酯含量分析5

5.2.1RP-HPLC法5

5.2.2LC-TSP-MS法5

5.2.3GC-MS法6

5.2.4核磁共振法6

5.3银杏酸的定量分析6

5.3.2UV定量分析方法6

5.3.3衍生化-GC定量分析方法6

6结论及展望6

参考文献8

致谢10

黄飞

（凯里学院化学与材料工程学院化学）

摘要:

随着人们对银杏叶提取物药理和临床认识的不断深入以及银杏叶活性物质提取技术和质量控制手段的进步，银杏叶提取物的相关产业也获得了快速的发展。

本文通过参阅国内外的相关文献报道，对银杏叶提取物的生理活性及其相关活性物质的测定方法进行了归纳分析，以期为相关工作者提供参考。

关键词：

银杏叶提取物，提取方法；

制剂；

质量控制

PhysiologicalactivityofGinkgobilobaextractandqualitycontrolmethods

HuangFei

（CollegeofChemistryandMaterialsEngineering,KailiuniversityChemistry）

AspeopleofGinkgobilobaextractdeeperunderstandingofthepropertiespharmacologicalandclinical.Moreover,activesubstancesofGinkgobilobaextractiontechnologyandqualitycontrolofthemeansofprogress.Ginkgobilobaextractindustryalsogainedrapiddevelopment.ReportedathomeandabroadtoparticipateinthephysiologicalactivityoftheGinkgobilobaextractanditsrelatedmethodfordeterminationofactivesubstancesweresummarizedandanalyzedinordertoprovideareferencefortherelevantworkers.

Keywords：

Ginkgobilobaextract;

extractionmethods;

preparations;

qualitycontrol

1引言

银杏叶为银杏科植物银杏（GinkgobilobaL）的干燥叶，性甘、苦、涩、平，归心、肺经，具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛等作用，用于冠心病、心绞痛和高血脂症。

目前，《中国药典》已经收载了包括银杏叶在内的5种相关的品种。

《欧洲药典》规定了银杏叶及其银杏叶提取物的相关标准，《美国药典》也已经将银杏叶及其制剂作为了食品补充剂而收录。

经过20多年的发展，国内银杏叶提取物的厂家已成规模。

目前银杏叶提取物的质量控制已成为制约提取物制剂发展的重要因素，而影响银杏叶提取物质量的主要因素涉及到生产工艺和含量的检测方法，因此本文就银杏叶活性物质的提取及检测方法进行总结。

2银杏叶化学成分

银杏叶及其制剂的主要活性成分为黄酮类化合物和银杏内酯。

此外，也含有有机酸类、酚类以及原花青素类等。

目前国内外研究者从银杏叶中分离出来的黄酮类化合物已经有40多种，据分子结构的不同其可以分为黄酮、黄酮醇及其苷、双黄酮和儿茶素等几大类，其中黄酮（醇）苷类是主要的活性成分[1-2]。

银杏内酯为二萜类内酯，其主要分为银杏内酯A、B、C、J以及白果内酯。

银杏叶中的酚酸类成分属于羟基取代的水杨酸衍生物，主要有白果酸、白果新酸、白果酚、银杏酸等。

此外，银杏叶还含有氨基酸、蛋白质、糖类、维生素、矿物质、微量元素等成分[3]。

相关研究显示，银杏的酚酸具有一定的细胞毒性，其可以导致过敏和致突变，引起阵发性痉挛和神经麻痹等，因此应对其在制剂中的含量加以控制[4]。

但GBE（银杏叶提取物）的化学成分较为复杂，目前尚无统一质量标准，国际上公认的银杏叶制剂质量控制标准是德国Schwabe（舒培药厂）公司1991年的专利GBE761标准，即黄酮>

24％，总内酯>

6％（其中银杏2.5％～4.5％，白果内酯2.0％～4.0％），同时限定银杏酸水平在5mg·

kg-1以内[3]。

3生理活性

3.1促进血液循环　　

银杏叶提取物（GinkgobilobaP.E.）能同时促进大脑和身体肢体的血液循环。

银杏叶提取物（GinkgobilobaP.E.）的一个主要保健功能就是抑制一种称为血小板活化因子（PAF）的物质，PAF是一种从细胞中释放的介质，会导致血小板聚集（堆积在一起）[5]。

高含量的PAF会导致神经细胞损伤，中枢神经系统血流量降低，发炎，和支气管收缩。

与自由基非常相似，高PAF水平也会导致衰老。

银杏内酯和白果内酯可在缺血（体内组织缺少氧气）时期内保护中枢神经系统的神经细胞不受损伤。

该功能可能对中风的患者有辅助治疗的作用。

除了抑制血小板粘着外，银杏提取物调节血管张力和弹力。

换句话说，其可令血管循环更加有效率。

提升循环效率作用对循环系统中的大血管（动脉）和较小血管（毛细血管）都有同样作用[6]。

3.2抗氧化作用　　

银杏叶提取物（GinkgobilobaP.E.）在大脑，眼球视网膜和心血管系统中可发挥抗氧化特性[7]。

其在大脑和中枢神经系统中的抗氧化作用可能有助于防止因年龄导致的大脑功能衰落。

银杏叶提取物在大脑中的抗氧化功能特别使人感兴趣。

大脑和中枢神经系统特别易受自由基攻击。

自由基导致大脑损伤被广泛认为是导致伴随衰老而来的多种疾病的影响因素，其中甚至包括阿兹海默症[8]。

3.3抗衰老功能　　

银杏叶提取物（GinkgobilobaP.E.）提升大脑血流量并对神经系统有极好的滋补作用[8]。

包含上万患者的数百次科学研究证实了银杏叶提取物的功效对包括大脑血流不足和老年患者的智力衰退在内的诸多问题的效力。

银杏对许多衰老的可能症状都有很好的效果，例如：

焦虑和忧郁、记忆损伤、难以集中注意力，机敏度下降、智力下降、眩晕，头痛、耳鸣（耳中鸣响）、视网膜黄斑部退化（成人失明的最普遍原因）、内耳骚动（其会导致部分失聪）、末端循环不良、阴茎血流不良导致的阳痿[9]。

3.4糖尿病的治疗

目前医学上已经有使用银杏叶提取物代替胰岛素供糖尿病人使用的药物了，说明银杏叶具备胰岛素的调节血糖的功能，很多的葡萄糖耐量试验都证明了银杏叶提取物对调节血糖、改善胰岛素抵抗，从而减少胰岛素抗体、增强胰岛素的敏感性效果明显[9]。

3.5高血压的治疗　　

银杏叶提取物可以同时减轻胆固醇、三酰甘油、极低密度脂蛋白对人体的不利影响，减轻血脂，改善微循环，抑制凝血，这些对高血压的治疗效果显著[10-11]。

4银杏叶活性成分提取

我国对银杏叶的提取和生产技术落后于国外，目前我国对银杏叶中活性成分的提取主要有以下方法：

4.1溶剂提取法

采用溶剂提取法时，工艺步骤多，周期长，黄酮的提取率高，但存在溶剂残留等问题。

常用的溶剂主要有甲醇或乙醇，一般高浓度醇（90~95%）适合于提取黄酮苷元，60%的醇适合于提取糖苷，一般采用热提取或浸渍提取1~4次，这是国内采用的较多的一种方法[12]。

4.2树脂法

王成章等研究先用45%的乙醇水溶液提取，过滤，浓缩后，再加入絮凝剂沉淀，调pH为8.5~9.0，沉降原色花素，及毒性成分后，再上聚酰胺树脂-D-101大孔吸附树脂，依次用水，20%的乙醇水溶液，70%的乙醇水溶液洗脱，浓缩干燥得提取物。

其中黄酮醇苷含量为25.1%，提取率为1.28%，该方法的优点是提取物有效成分含量高，树脂可再生处理[12]。

4.3超临界CO2提取法

超临界流体萃取技术（SCFE）是一种新型的提取分离技术，该技术利用流体在临近点附近某区域内，他与待分离的混合物中的溶质，具有异常相平衡行为和传递性能，且他对溶质的溶解随着温度和压力的变化而变化，利用该特性他可从多种液态或固态中萃取分离组分。

近几年来，该技术特别适用于分离热敏性，高沸点成分，用于开发附加值高，用量少的产品。

与传统的水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法和压窄法相比，该方法的最大优点在于在接近室温下操作，无溶剂残留，回收率高，操作简单。

姚渭溪等采用超临界CO2法从银杏叶中提取黄酮类化合物，提取率为4.1%，其中黄酮苷占35%以上。

邓启焕等采用超临界CO2法从银杏叶中提取黄酮类化合物，研究结果显示黄酮的含量为28%，银杏内酯的含量为7.2%，均高于国际公认标准[13]。

4.4超声波提取法

近年来，超声波技术已用于天然产物活性成分的提取，具有能耗低，效率高，不破坏活性物质的特点。

郭国瑞等人以水为介质，在较低温度下，对银杏叶进行超声波处理提取黄酮苷，结果表明，与常规水提取方法相比，该方法浸取的黄酮是水提法的300%，同时具有省时高效节能的目的。

刘峥利用超声波法从银杏叶中提取总黄酮，用均匀设计法确定了超声萃取的最佳提取条件为：

乙醇浓度67%，浸泡39min，V（提取体积）:

m（银杏叶）=60:

1，对提取液中的杂质采用聚酰胺树脂出除去[14-15]。

4.5微波提取法

近年来，微波在化学中得到了广泛的应用，无论是促进化学反应的高效性和强选择性方面，还是在天然产物活性成分的提取方面，都具有很强的实用性。

微波萃取法由于对体系中的不同成分进行选择性加热的方法，而使得待分离成分被分离出。

另一方面，微波提取由于受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂多，而且微波加热是对物质直接加热，所以加热效率高，升温迅速，大大提高了萃取率。

段蕊等利用微波法提取银杏叶中的黄酮类物质，用175w微波处理样品5min，在70℃用乙醇（80%）提取1h，得到的黄酮类物质的提取率比不使用微波法提高了18.8%，此法提取效率高，并缩短提取时间[16]。

4.6高速逆流色谱技术提取法

高速逆流色谱（high-speedcountercurrentchromatography，HSCCC）技术是一种不用任何固定载体的液-液分配色谱技术。

国内已有学者采用HSCCC成功分离制得白果内酯单体，和以银杏内酯A、银杏内酯B为主要成分的化合物。

研究结果显示该方法高效，分离的产品纯度高，零吸附和无污染等优点，并使用该方法来制备银杏黄酮和银杏内酯的标准品[17]。

5银杏叶提取物及其制剂的质量控制方法

银杏叶提取物主要基于银杏黄酮和银杏内酯两种活性物质含量方面的研究，而银杏酸是影响银杏提取物的重要因素，因此质量控制主要基于以上三方面的控制。

5.1银杏黄酮含量分析

5.1.1紫外分光光度（UV）法

在银杏叶的甲醇提取物中，加入亚硝酸钠及硝酸铝进行络合反应。

以黄酮提取物标准品为对照，于415nm波长处进行比色测定黄酮的含量。

紫外分光光度法，仪器简单，操作方便，国内外标准大部分以黄酮的总含量作为标准，此方法测定的是混合体系的药物含量，而且没有经过分离纯化的样品非常容易受到其它成分的干扰，测定误差相对较大[18-20]。

5.1.2HPLC法

HPLC是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

该方法专属性强，准确度高，灵敏度高，重现性好。

按进样方式可以分为直接进样法测定和经酸水解后，梯度洗脱分析测定[21-30]。

目前该方法在银杏黄铜分析中已经获得了广泛应用.

5.1.3胶束电动毛细管电泳（MECC）法

胶束电动毛细管色谱（MicellarElectrokineticCapillaryElectrophoresis,MECC）胶束电动毛细管色谱，在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠，形成胶束，被分离物质在水相和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。

本模式能用于中性物质的分离。

邓永智等研究显示该方法的分离效果好，灵敏度高，样品和试剂的消耗量都很低且具有较强的数据分析能力。

但设备的价格昂贵，限制了其应用的普遍性[31-32]。

5.1.4核磁共振（NMR）法

刘建庄等通过将样品酸性水解，得3种GBE苷元，并根据NMR图谱对三者进行了定量分析，并确定了山萘酚、槲皮素、异鼠李素这3种主要苷元的信号归属和质量百分含量。

这是近年来国内、外首次用NMR仪对银杏黄酮混合物进行指纹图谱及定量分析[33]。

5.2银杏内酯含量分析

5.2.1RP-HPLC法

萜类内酯在银杏叶中含量较低且紫外吸收峰很弱，难以用紫外检测器进行鉴定分析，所以大多数情况下采用示差折光检测器（RI）检测。

该方法的灵敏度可达1μg，回收率达95%[34]。

5.2.2LC-TSP-MS法

银杏内酯的TSP质谱图显示有一个强的类分子离子峰，无其他碎片离子，检测这些符合类分子离子的不同的离子流就可以确定不同的银杏内酯[35-36]。

5.2.3GC-MS法

银杏内酯为非挥发性物质，在用GC测定前须将内酯衍生化，衍生化后的物质进入GC分离，再用MS测定其碎片峰[37]。

5.2.4核磁共振法

由于银杏内酯A、B、C、J及白果内酯的结构上均有H-12，其共振信号一般在6.00~6.55之间且在适当的溶剂中，5种内酯的H-12的质子化学位移又各有差异，故可以从积分值直接计算5种内酯的各自含量[38]。

5.3银杏酸的定量分析

“欧、美药典”则以银杏酸（C13：

0、C15：

0和C17：

1）的总和计，限度为百万分之五。

而《中国药典》银杏叶提取物项下规定总银杏酸以银杏酸（C13：

l、C17：

l和C17：

2）的总和计，不得高于百万分之十。

目前针对银杏酸含量的测定方法较多[39-40]，主要有以下方法：

5.3.1HPLC定量分析方法

高效液相法专属性强，准确度高，灵敏度高，重现性好，因此得到广泛应用。

孔玉霞等本文采用反相高效液相色谱法，建立了以银杏酸（C13:

P0）为对照品，以RP-C18为固定相，甲醇:

水:

乙酸水溶液（90:

9.6:

0.4）为流动相的等度洗脱，回收率高（96.8％），此方法可应用于银杏提取物中银杏酸的含量测定[41]。

5.3.2UV定量分析方法

秦俊哲等大孔吸附树脂DA201为固定相，石油醚:

乙酸乙酯:

冰醋酸（18:

1:

1）为展开剂对银杏酸进行分离纯化；

紫外分光光度法测定，波长为307nm．结果表明平均回收率为100.90％，测定结果同HPLC法结果对照无明显差异，适用于银杏叶中银杏酸含量的测定。

5.3.3衍生化-GC定量分析方法

王丽丽等在热辅助下，在线甲基衍生化-气相色谱法测定银杏叶中的银杏酸。

在300℃的进样口瞬间生成了银杏酸甲基衍生物，银杏叶中6种银杏酸得到很好的分离。

银杏叶样品中总银杏酸的含量为4.0-10.9mg/g。

该方法无需繁琐费时的衍生化和纯化等前处理步骤，不失为银杏叶中银杏酸测定的一种快速、简便、准确的方法[42]。

6结论及展望

银杏叶提取物含有多种的化学成分，其可以调节人体血液的循环，增强脑血流用，改善新陈代谢以及脑缺氧等，能够清除氧自由基和拮抗血小板活化因子功能，此外也能够使末梢血管、动脉以及毛细血管中的胆固醇和血质维持在正常的水平。

随着国内外对银杏叶提取物药理作用研究的不断深入，银杏叶提取物在临床中的应用也逐渐的获得认可，如治疗冠心病心绞痛、脑梗死、痴呆症以及糖尿病和肾病等。

银杏叶提取物及其制剂的质量控制主要在于2类活性成分（黄酮和内酯）和一类致敏性成分（银杏酸）研究。

目前，国内外普遍认可以总黄酮醇苷、萜类内酯和总银杏酸作为检测指标。

近年来，指纹图谱、完型黄酮苷的测定以及不同类成分的同时检测逐渐的引起了人们的重视，成为了新的研究热点。

但是银杏叶中其他含量较高的成分，如双黄酮、羧酸和聚丙烯醇等的研究则很少。

相信今后随着对有效成分的深入研究以及新理论、新技术和新仪器的不断开发运用，银杏叶提取物及其制剂的质量控制将会更加的合理、准确和规范。

随着银杏活性物质在提取技术手段以及质量控制手段方面不断进行方法创新与改进，银杏黄酮和内酯的含量的提高以及银杏酸含量的合理控制，为我国银杏黄酮产业的发展创造了条件。

但同时还存在其他问题，比如制剂的种类及治疗种类难以满足市场的不同种类人群的需要，因此除了在质量上把关之外，还应注重产品的市场化和竞争力。

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