核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法资料下载.pdf
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张金璧(1985),女,硕士研究生,研究方向:
动物遗传与发育生物学(表观遗传学方向)。
Tel:
025-4395278;
E-mail:
通讯作者:
刘红林(1966),教授,博士生导师,研究方向:
胚胎发育与分子遗传学。
Fax:
025-4395314;
DOI:
10.3724/SP.J.1005.2009.00325核酸蛋白质互作的生物化学研究方法张金璧,潘增祥,林飞,马雪山,刘红林南京农业大学动物科技学院,南京210095摘要:
研究核酸蛋白质的互作是揭示生命活动机理的基础,文章简要综述了用于研究核酸蛋白质互作的各种生物化学方法。
从体内、体外两个研究角度,针对核酸、蛋白以及复合物3个研究水平,概述了硝化纤维膜过滤实验、足迹法、EMSA、Southwestern杂交等经典分析方法的原理、发展和运用。
还着重介绍了最近在表观遗传学领域中广泛运用的nChIP、xChIP等基本染色质免疫沉淀(ChIP)技术及其衍生出的ChIP-on-chip等方法。
关键词:
核酸;
蛋白质;
互作;
足迹;
染色质免疫沉淀BiochemicalmethodsfortheanalysisofDNA-proteininteractionsZHANGJin-Bi,PANZeng-Xiang,LINFei,MAXue-Shan,LIUHong-LinCollegeofanimalscienceandtechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,ChinaAbstract:
InvestigationofDNA-proteininteractionsisfundamentaltounderstandthemechanismunderlyingavarietyoflifeprocesses.Inthisarticle,varioustypesofbiochemicalmethodsinDNA-proteininteractionstudyinvivoandinvitroatthelevelofDNA,protein,andthecomplex,respectivelywerebrieflyreviewed.TraditionalassaysincludingNitrocellulosefilter-bindingassay,Footprinting,EMSA,andSouthwesternblottingweresummarized.Inaddition,chromatinimmunopre-cipitationtechniquesincludingnChIP,xChIP,andChIP-on-chip,whichwerewidelyusedinepigenetics,wereparticularlyintroduced.Keywords:
nucleicacid;
protein;
interaction;
footprinting;
chromatinimmunoprecipitation(ChIP)核酸蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用,二者的协作是各种生命现象的基础。
将细胞或细胞器中的蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用联系起来,是综合研究一个完整的生物学途径的核心内容1。
近半个世纪以来,研究者们在核酸蛋白质复合物的构成和分解过程中进行了大量探索,发展了一系列研究其互作关系的方法技术,其中,生物化学相关方法一直是重点与主流。
生物化学法主要利用酶或其他化学制剂,通过切割、修饰等作用来分析或分辨存在相互作用的核酸和蛋白复合物,研究其间潜在或实际的结合能力和结合方式。
其中DNase、Exo足迹法以及更加精练的足迹技术,如羟基自由基足迹分析、保护/干扰实验等,在鉴别潜在的DNA靶点的基础上可进一步用于研究DNA-蛋白复合物中的DNA构成;
消化纤维膜过滤法、凝胶阻滞分析以及Southwestern印万方数据326HEREDITAS(Beijing)2009第31卷迹等能用作结合位点确定后相关蛋白的分离分析;
随着表观遗传学的兴起,建立在DNA-蛋白交联基础上的染色质免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipita-tion,ChIP)技术迅速发展起来,成为探索复杂的DNA-蛋白复合物结合情况的重要手段,被广泛运用于转录复合体和组蛋白修饰的研究。
本文就相关方法的原理、应用及发展情况,从体内、体外两个方面进行综述。
1体外的生化研究方法在对于蛋白质核酸互作的多数研究,尤其是早期研究中,目的蛋白和目的核酸被分别提取出来,在人工条件下进行孵育结合,进行相关研究。
虽然实际上在生物体中,二者有可能因为空间、电荷等各种关系无法接近而产生作用,但体外方法有效地体现了核酸和蛋白质能够发生互作的潜力,为核酸蛋白质研究所广泛运用。
1.1硝化纤维膜过滤实验膜过滤方法在核酸蛋白质复合物研究中渊源已久,最初用于RNA蛋白质的互作研究2,后由Jones和Berg3于1966年首次将其用于DNA蛋白质的研究中。
其原理是蛋白与硝化纤维膜(Nitrocellulosefilter,NCF)结合,但DNA不与其结合。
将标记过的DNA与蛋白质共同孵育,用NCF过滤混合物,则DNA能够通过NCF,而DNA-pro-tein复合物留在NCF上。
随后干燥NCF,通过标记物定量分析留在滤膜上的复合物,即可判断二者的结合程度。
NC膜过滤的方法虽然在当前的研究中逐渐减少,但其操作快速、简单,能够定量地研究蛋白质与DNA相互作用,仍在分析较多个核酸蛋白质的互作关系中有一定用途。
Tran等4在蛋白互作研究中,用膜过滤法确定促旋酶的DNA结合特性,Haque等5在研究线粒体翻译起始因子与核糖体的互作关系时,用此方法分析起始复合物中RNA与核糖体蛋白的结合量变化情况;
Posner等6结合芯片作用原理,用滤膜板一次性检验384个G蛋白联合受体的可能结合部位。
1.2足迹法足迹法最大的特点在于能确定蛋白结合DNA的片段长度,其基本原理与DNA化学测序法相似,首先将待测双链DNA片段进行标记,然后加入适当浓度的探针对DNA进行消化剪切,由于剪切具有随机性,在反应完全时可将DNA切成单核苷酸。
若控制探针浓度,将DNA部分消化,就可以形成一个单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸n核苷酸的混合物7。
经变性后电泳分离,放射自显影,即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。
但当结合上蛋白时,相应的DNA序列不会受探针的攻击,因而在放射自显影图谱上DNA梯度条带在相应DNA结合蛋白的结合区域中断,形成一空白区域,恰似蛋白质在DNA上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法。
具体原理见图1。
随着可选用的探针逐渐丰富,足迹法的具体研究方法和功能也丰富起来,针对不同用途选取不同的探针,在解决多种实际问题中起到了很大作用。
用于互作分析的探针主要有两种:
生物酶探针和化学探针,以下分别进行介绍。
1.2.1酶足迹法生物酶探针特异性好,一般不会与要研究的结合蛋白作用,不会扰乱DNA与蛋白质的互作。
因此在脆弱的DNA蛋白质复合体中,酶探针更受欢迎8。
DNase和exonuclease是两种最主要的生物酶探针,在定位与蛋白质结合的DNA序列上有较大优势。
1.2.1.1DNaseI足迹DNase是直径约40的蛋白,结合在DNA小沟,独立地切割两条链的磷酸骨架9。
由于其体积较大,切割作用更容易受空间位阻作用的影响,不能切割到有蛋白覆盖的区域及周边的DNA,因此是足迹法中确定DNA蛋白结合与否的理想方法之一,可以确定结合在蛋白上的DNA的片段长度,但不能给出具体核酸序列。
DNase足迹法由Galas和Schmitz7于1978年首次运用于DNA序列特异性结合蛋白的研究中。
通常是将DNA单链末端标记,然后与结合蛋白反应,复合物用DNase部分消化。
结合蛋白的区域受到蛋白保护,免受DNase攻击,而产物由于分子量的差异,经电泳和放射自显影即可得到一系列条带,与对照消化产物的连续条带相比,其中空缺部分即为蛋白的结合区域。
万方数据第3期张金璧等:
核酸蛋白质互作的生物化学研究方法327图1足迹法原理通过同一DNA片段与多个蛋白的足迹分析,可推断这些蛋白的结合域是否有交叠或相互分开,从而推测这些蛋白之间的协作对基因的调节,如Makarewicz等10用单体PhoP进行DNase足纹法分析得出,PhoP_P二聚体在phyC启动子上有两个结合区域,在启动子-35位的结合促进启动子活性,而在-10的结合抑制其活性;
Matta等11在拮抗酶AtoC和细菌调控元件的互作研究中,用DNase足迹法检测AtoC的结合位点,得出其在两个20bp的位置结合,序列分析得出这两个位置正好构成与转录起始位点相关的回文序列。
DNase足迹法在确定单一转录因子结合区的研究中应用也很广泛。
近期应用此法的一个典型例子是Connaghan-Jones等12在研究孕酮受体与小鼠乳腺肿瘤病毒启动子的互作时,采用DNase足迹法检测出PR-a在启动子上的5个特异结合区域。
当然,DNase法亦有其缺点。
由于一些结合蛋白也会与其发生作用,导致一些DNase超敏感位点的存在。
另外DNase对DNA的切割有位点偏好性,因此得出的电泳梯度条带是不均匀的,而且实验中底物需要量大,不能自动区别开DNA蛋白质复合体上的多个组分。
这些不足使DNase技术具有一定局限性。
1.2.1.2外切酶足迹法外切酶(Exonuclease,Exo)加工过程独特,使其在研究序列特异性结合蛋白的工作中成为一种常用的探针,适用于蛋白结合位置DNA序列的分析。
Exo是单体酶,分子量小(28000kDa),具有35外切酶活性、RNaseH活性、3磷酸酶活性和AP核酸内切酶活性13。
Exo足迹法运用了其35外切酶活性14,当Exo切割双链DNA时,有蛋白结合的位置被保留下来,产生的两条单链DNA片段经过变性凝胶电泳分析,放射自显影检测即可得到结合片段大小。
一般来说,Exo足迹的切割片段要比DNase略小一些,所有的未被结合的DNA都被完全消化,这是Exo的优势所在,不存在自由DNA产生的背景问题。
不过使用Exo探针的先决条件是,蛋白和DNA互作的半衰期不能少于ExoIII作用所需要的时间8。
Exo足迹法最早由Shalloway等14采用,通过此方法,他们用SV40T抗体找出了SV40DNA复制起始位点结合区域。
在新近的研究中仍受欢迎,如Wu等15在对铂类抗癌药物的研究中用Exo足迹法验证了铂类药物与核苷酸序列的结合情况,在药物交联位置酶切明显受阻,由此证实了铂类抗癌药万方数据328HEREDITAS(Beijing)2009第31卷在治疗中的可行性。
Chen等16将荧光染色技术和Exo足迹结合,由于酶切DNA时激发了结合在探针上的SYBRGreenI的释放,荧光强度在酶切和非酶切位点显示出强弱差别并能被方便地检测出来,这种改进使得Exo足迹法更快速敏感而且经济。
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