高效液相色谱方法的建立_精品文档资料下载.pdf

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高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立步骤步骤步骤步骤样品制备样品制备样品制备样品制备分离模式的选择分离模式的选择分离模式的选择分离模式的选择色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择洗脱方式的优化洗脱方式的优化洗脱方式的优化洗脱方式的优化检测方式的选择检测方式的选择检测方式的选择检测方式的选择色谱理论简单回顾色谱理论简单回顾色谱理论简单回顾色谱理论简单回顾分离和保留分离和保留分离和保留分离和保留:

@#@保留因子保留因子保留因子保留因子，分离因子（选择性），分离因子（选择性），分离因子（选择性），分离因子（选择性）谱带展宽谱带展宽谱带展宽谱带展宽:

@#@柱外效应柱外效应柱外效应柱外效应:

@#@分离度：

@#@分离度：

@#@分离度：

@#@分离度：

@#@，峰对称性：

@#@拖尾因子峰对称性：

@#@拖尾因子峰对称性：

@#@拖尾因子峰对称性：

@#@拖尾因子，对称因子对称因子对称因子对称因子校正因子校正因子校正因子校正因子:

@#@（）WWttRRR21122+=+=114kknRdWThf2105.0=basymmetryh1.0uCuCuBAHms+=22det22tubeinjext+=10=ttkR12kk=CACAfRRss=HPLCHPLC方法建立的步骤方法建立的步骤方法建立的步骤方法建立的步骤收集样品信息，明确分析的目的和要求收集样品信息，明确分析的目的和要求收集样品信息，明确分析的目的和要求收集样品信息，明确分析的目的和要求选择样品制备方法选择样品制备方法选择样品制备方法选择样品制备方法确定检测方法和条件确定检测方法和条件确定检测方法和条件确定检测方法和条件确定确定确定确定HPLCHPLC分析模式，选择相应色谱柱分析模式，选择相应色谱柱分析模式，选择相应色谱柱分析模式，选择相应色谱柱优化分离条件优化分离条件优化分离条件优化分离条件定性、定量分析定性、定量分析定性、定量分析定性、定量分析方法验证方法验证方法验证方法验证样品信息样品信息样品信息样品信息样品中的化学成分，及各成分的含量范围样品中的化学成分，及各成分的含量范围样品中的化学成分，及各成分的含量范围样品中的化学成分，及各成分的含量范围化合物的结构或官能团化合物的结构或官能团化合物的结构或官能团化合物的结构或官能团化合物的分子量化合物的分子量化合物的分子量化合物的分子量化合物的酸碱性和化合物的酸碱性和化合物的酸碱性和化合物的酸碱性和pKapKa、pKbpKb值值值值适宜的样品溶剂及溶解度适宜的样品溶剂及溶解度适宜的样品溶剂及溶解度适宜的样品溶剂及溶解度化合物的紫外吸收光谱化合物的紫外吸收光谱化合物的紫外吸收光谱化合物的紫外吸收光谱分析目的和要求分析目的和要求分析目的和要求分析目的和要求主主主主成分的定性、定量成分的定性、定量成分的定性、定量成分的定性、定量杂质分析，如有关物质及降解产物等杂质分析，如有关物质及降解产物等杂质分析，如有关物质及降解产物等杂质分析，如有关物质及降解产物等药物代谢动力学或药物代谢物研究药物代谢动力学或药物代谢物研究药物代谢动力学或药物代谢物研究药物代谢动力学或药物代谢物研究中药有效成分或指标成分的定性、定量中药有效成分或指标成分的定性、定量中药有效成分或指标成分的定性、定量中药有效成分或指标成分的定性、定量中药指纹图谱分析中药指纹图谱分析中药指纹图谱分析中药指纹图谱分析合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析准确度准确度准确度准确度精密度精密度精密度精密度分离度分离度分离度分离度灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度分析速度分析速度分析速度分析速度样品处理样品处理样品处理样品处理溶解、稀释、过滤溶解、稀释、过滤溶解、稀释、过滤溶解、稀释、过滤超声萃取超声萃取超声萃取超声萃取溶剂萃取溶剂萃取溶剂萃取溶剂萃取固相萃取固相萃取固相萃取固相萃取多种方式联合使用多种方式联合使用多种方式联合使用多种方式联合使用柱前衍生，柱后衍生柱前衍生，柱后衍生柱前衍生，柱后衍生柱前衍生，柱后衍生根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法注意：

@#@供试品溶剂与色谱条件的匹配注意：

@#@供试品溶剂与色谱条件的匹配注意：

@#@供试品溶剂与色谱条件的匹配注意：

@#@供试品溶剂与色谱条件的匹配HPLCHPLC模式的选择模式的选择模式的选择模式的选择样品样品样品样品溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于水溶于水溶于水溶于水溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃非离子化非离子化非离子化非离子化离子化离子化离子化离子化溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于水溶于水溶于水溶于水溶于正己烷溶于正己烷溶于正己烷溶于正己烷溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇/水水水水或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈/水水水水硅胶的正相色谱硅胶的正相色谱硅胶的正相色谱硅胶的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相色谱离子对键合相的反相色谱离子对键合相的反相色谱离子对键合相的反相色谱用硅胶的正相色谱用硅胶的正相色谱用硅胶的正相色谱用硅胶的正相色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换色谱大孔填料的离子交换色谱大孔填料的离子交换色谱大孔填料的离子交换色谱用大孔填料的反相色谱用大孔填料的反相色谱用大孔填料的反相色谱用大孔填料的反相色谱分子量分子量分子量分子量2,0002,000分子量分子量分子量分子量2,0002,000HPLCHPLC分离模式及应用范围分离模式及应用范围分离模式及应用范围分离模式及应用范围生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子亲和配基，非成键亲和配基，非成键亲和配基，非成键亲和配基，非成键作用力，分子识别作用力，分子识别作用力，分子识别作用力，分子识别缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液亲和色谱亲和色谱亲和色谱亲和色谱应用范围应用范围应用范围应用范围色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱流动相流动相流动相流动相方法方法方法方法光学异构体（对映体）光学异构体（对映体）光学异构体（对映体）光学异构体（对映体）各种手性填料各种手性填料各种手性填料各种手性填料水水水水-有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂手性色谱手性色谱手性色谱手性色谱水溶性蛋白质，疏水性随盐浓水溶性蛋白质，疏水性随盐浓水溶性蛋白质，疏水性随盐浓水溶性蛋白质，疏水性随盐浓度而改变度而改变度而改变度而改变类似反相填料，但类似反相填料，但类似反相填料，但类似反相填料，但疏水性小得多疏水性小得多疏水性小得多疏水性小得多缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液疏水疏水疏水疏水-相互作用相互作用相互作用相互作用色谱色谱色谱色谱大分子化合物，蛋白质或聚合大分子化合物，蛋白质或聚合大分子化合物，蛋白质或聚合大分子化合物，蛋白质或聚合物等物等物等物等GFC:

@#@GFC:

@#@二醇基；@#@二醇基；@#@二醇基；@#@二醇基；@#@GPC:

@#@GPC:

@#@聚苯乙烯或聚苯乙烯或聚苯乙烯或聚苯乙烯或硅胶硅胶硅胶硅胶水相（水相（水相（水相（GFCGFC）；@#@）；@#@）；@#@）；@#@纯有机纯有机纯有机纯有机溶剂（溶剂（溶剂（溶剂（GPCGPC）分子（尺寸）排分子（尺寸）排分子（尺寸）排分子（尺寸）排阻色谱阻色谱阻色谱阻色谱蛋白，多肽，核酸；@#@无机离子蛋白，多肽，核酸；@#@无机离子蛋白，多肽，核酸；@#@无机离子蛋白，多肽，核酸；@#@无机离子分离应首选离子色谱分离应首选离子色谱分离应首选离子色谱分离应首选离子色谱阴离子交换或阳离阴离子交换或阳离阴离子交换或阳离阴离子交换或阳离子交换子交换子交换子交换缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱难溶或不溶于难溶或不溶于难溶或不溶于难溶或不溶于水水水水-有机混合溶有机混合溶有机混合溶有机混合溶液的化合物，异构体（立体，液的化合物，异构体（立体，液的化合物，异构体（立体，液的化合物，异构体（立体，位置）分离以硅胶更好位置）分离以硅胶更好位置）分离以硅胶更好位置）分离以硅胶更好氰基，氨基，二醇氰基，氨基，二醇氰基，氨基，二醇氰基，氨基，二醇基，硅胶基，硅胶基，硅胶基，硅胶有机溶剂的混合溶剂有机溶剂的混合溶剂有机溶剂的混合溶剂有机溶剂的混合溶剂正相正相正相正相HPLCHPLC酸酸酸酸碱性化合物或离子化合物碱性化合物或离子化合物碱性化合物或离子化合物碱性化合物或离子化合物C18C18，C8C8水水水水-有机溶剂，缓冲溶液有机溶剂，缓冲溶液有机溶剂，缓冲溶液有机溶剂，缓冲溶液和离子对试剂和离子对试剂和离子对试剂和离子对试剂离子对离子对离子对离子对HPLCHPLC能溶于能溶于能溶于能溶于水水水水-有机混合溶液的中有机混合溶液的中有机混合溶液的中有机混合溶液的中性或弱酸、弱碱性化合物性或弱酸、弱碱性化合物性或弱酸、弱碱性化合物性或弱酸、弱碱性化合物C18C18，C8C8，苯基，苯基，苯基，苯基，氰基氰基氰基氰基水水水水-有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂反相反相反相反相HPLCHPLC选择色谱柱选择色谱柱选择色谱柱选择色谱柱1.1.根据样品特性选择分离模式根据样品特性选择分离模式根据样品特性选择分离模式根据样品特性选择分离模式2.2.根据色谱柱性能根据色谱柱性能根据色谱柱性能根据色谱柱性能3.3.根据分离规模来选择根据分离规模来选择根据分离规模来选择根据分离规模来选择4.4.柱硬件状态柱硬件状态柱硬件状态柱硬件状态色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择不同的传质阻力，分离速度，柱容量不同的传质阻力，分离速度，柱容量不同的传质阻力，分离速度，柱容量不同的传质阻力，分离速度，柱容量全全全全多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒颗粒类型颗粒类型颗粒类型颗粒类型柱柱柱柱容量容量容量容量保留位点的多少保留位点的多少保留位点的多少保留位点的多少比比比比表面积表面积表面积表面积色谱柱使用寿命色谱柱使用寿命色谱柱使用寿命色谱柱使用寿命pH28（36）,pH111pH28（36）,pH111；@#@40804080CCpHpH，温度适用范围温度适用范围温度适用范围温度适用范围碱性化合物的峰形，选择性碱性化合物的峰形，选择性碱性化合物的峰形，选择性碱性化合物的峰形，选择性屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用封端技术封端技术封端技术封端技术柱容量柱容量柱容量柱容量柱床实密性柱床实密性柱床实密性柱床实密性柱填料量柱填料量柱填料量柱填料量选择性，水性流动相的耐受性选择性，水性流动相的耐受性选择性，水性流动相的耐受性选择性，水性流动相的耐受性键合相修饰键合相修饰键合相修饰键合相修饰键合方式键合方式键合方式键合方式容量因子，保留时间容量因子，保留时间容量因子，保留时间容量因子，保留时间含碳量含碳量含碳量含碳量键合密度键合密度键合密度键合密度适用的化合物分子量范围适用的化合物分子量范围适用的化合物分子量范围适用