柑橘皮化学成分分析实验报告Word格式.docx

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掌握气相色谱法分离定量香精油

掌握溶剂回流法提取类黄酮

掌握水蒸气蒸馏法提取香精油

掌握紫外光谱法测定类黄酮含量

有效成分分析

有效成分提取

掌握原子吸收测定金属离子含量橙皮苷含量

3、实验目的

（1）掌握水溶剂浸渍法提取维生素Ｃ和微量元素。

（2）掌握醇类回流法提取类黄酮成分。

（3）掌握水蒸气蒸馏提取香精油成分。

（4）掌握碘量法测定维生素Ｃ含量。

　（５）掌握原子吸收光谱测定金属离子。

（６）掌握紫外光谱法测定类黄酮含量。

　（7）掌握建立GＣ混合物分离的色谱条件，并以外标法测定相关物质的含量。

二、实验原理

1、柑橘皮有效成分的提取

从天然产物中提取化学成分,常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法及升华法。

（1）溶剂提取法

溶剂提取法是实际工作中应用最普遍的方法，根据天然产物中各化学成分的溶解性能，选用对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂,用适当的方法将有效成分尽可能完全地从药材组织中溶解出来。

溶剂提取法的基本原理是在渗透、扩散作用下,溶剂渗透入药材组织细胞内部,溶解可溶性物质,形成细胞内外溶质的浓度差而产生渗透压，在渗透压的作用下，细胞外的溶剂不断进入药材组织中,溶解可溶性成分，细胞内的浓溶液不断向外扩散，如此反复,直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡即完成一次提取。

滤出此溶液,再加入新溶剂,使细胞内外产生新的浓度差，提取可继续进行,直至所需成分全部或大部分溶出。

溶剂提取法的关键是选择合适的溶剂，一种好的溶剂应对所提成分有较大的溶解度,而对共存杂质的溶解度很小。

良好溶剂的选择应遵循“相似相溶”的经验规律。

一般说来，只要溶剂的极性与化学成分的极性相似，化学成分就易被溶解。

按照溶剂极性大小顺序以及溶解性能不同,可将其分为水、亲水性有机溶剂、亲脂性有机溶剂三类：

水是强极性溶剂，对药材组织的穿透力大，中药中某些亲水性成分如糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、有机酸盐、生物碱盐、大多数苷类、无机盐等,都可以水为提取溶剂。

柑橘皮中维C和微量元素由于其很好的水溶性,故用水作溶剂提取。

亲水性有机溶剂　是指甲醇、乙醇、丙酮等极性较大且能与水相互混溶的有机溶剂，其中乙醇最为常用。

柑橘皮中的类黄酮物质在醇中有很好的溶解性，可用乙醇回流的方法提取。

亲脂性有机溶剂如石油醚、苯、乙醚、氯仿、醋酸乙酯等，此类溶剂的特点是极性小，与水不能混溶,具较强的选择性,只能提取亲脂性成分,如挥发油、油脂、叶绿素、树脂、某些游离生物碱及一些苷元等。

溶剂的选择要综合考虑溶剂的极性、被提取成分及共存的其他成分的性质三方面的因素来决定，同时还应兼顾考虑溶剂是否使用安全、价廉易得、浓缩方便等特点。

（2）水蒸气蒸馏

水蒸气蒸馏是用来分离和提纯液态或固态有机化合物的一种方法，常用于下列几种情况:

（1）某些沸点高的有机化合物，在常压下蒸馏虽可与副产品分离,但易被破坏；

（2）混合物中含有大量树脂状杂质或不挥发性杂质，采用蒸馏、萃取等方法都难于分离；

（3）从较多固体反应物中分离出被吸附的液体。

使用水蒸气蒸馏这种分离方法是有条件限制的,被提纯物质必须具备以下几个条件：

（1）不溶或难溶于水；

（2）与沸水长时间共存而不发生化学反应;

（3）在１00℃左右必须具有一定的蒸气压（一般不小于１.33kPa）

柑橘香精油由柠檬烯，ｂetａ-蒎烯等纯碳氢烯烃和高级醇类,醛类,酮类,酯类组成的含氧化合物组成。

这些成分不溶于水,沸点较高,易被空气中的氧气氧化。

因此常用水蒸气蒸馏提取。

2、维生素C的测定原理

　维生素Ｃ是可溶于水的无色结晶,是一种分子结构最简单的维生素。

维生素C有防治坏血病的功能,所以在医药上常把它叫做抗坏血酸。

维生素C在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，维生素Ｃ具有较强的还原性，在酸性条件下，可被2，6-二氯靛酚氧化。

其结构如下所示：

　滴定法是维生素Ｃ含量测定最主要的方法,滴定法主要有２,6一二氯靛酚滴定法和碘量法。

本实验用碘量法。

碘的标定:

　　　　I2　+２Ｓ2O32-→　2I-　+Ｓ4O62-

硫代硫酸钠的标定：

６H++IO3-+5I－→　3I２+　3H２O

　　　　　　Ｉ2+　2S2O3２-→　２I-+S４O62-

以碘酸钾为基准物,在酸性条件下与过量的碘化钾反应生成Ｉ2与2S2O３2－反应。

３、原子吸收光谱测定金属离子

柑橘皮中的微量金属元素主要有钾、钙、铁、锌等，这些金属离子的含量测定可以原子吸收光谱法测定。

待测的柑橘皮的提取液在空气－乙炔火焰中原子化，在光路中分别测定锌对特定波长谱线的吸收。

含量计算需要先建立各个金属的标准工作曲线。

４、　紫外光谱测定黄酮类化合物

黄酮类化合物是一类具有C6一C3一C6结构的酚类化合物的总称，目前已从柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有6O余种,最常见的为橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素芸香苷等二氢黄酮类。

橙皮苷是目前柑橘属黄酮中最主要的研究对象,橙皮苷（又称陈皮苷或桔皮苷）为二氢黄酮苷类化合物,是橙皮素与葡萄糖和鼠李糖结合形成的苷类。

由于橙皮苷和Al（NO３）3溶液在80℃反应15min后能形成黄色络合物，通过波长扫描,可测其４20nm有最大吸收，通过橙皮苷对照品的系列溶液得到工作曲线后,进行样品中橙皮苷含量的测定。

5、气相色谱测定香精油

柑橘皮中含有多种香精油，其中含量最大的4种香精油分别是:

柠檬烯,beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。

这四种成分沸点不高,受热基本稳定,可用GＣ进行含量测定。

成分

结　　构

沸点

柠檬烯

1７５~177℃

Beｔa-蒎烯

15５～156℃

芳樟醇

１93～19４℃

乙酸芳樟酯

2１９～2２０℃

三、实验仪器与试剂

仪器：

滴定管（酸式、碱式）、移液管、碘量瓶、烧瓶、冷凝管、容量瓶、锥形瓶、铜壶、布氏漏斗、抽滤瓶、圆底烧瓶、研钵、循环水式多用真空泵、SpｅｃtＡA220原子吸收光度计、UV-２501ＰＣ型紫外-可见分光光度计、气相色谱仪GＣ-201４C

试剂：

橘皮、乙醇（9５%）、氯仿、碘酸钾、硫代硫酸钠、盐酸（2%）、硫酸（3Ｍ）、142６mｇ／L　Zｎ2+离子储备液、橙皮苷标准液等

四、实验步骤

1、维生素Ｃ提取及含量测定

（1）柑橘皮水溶性成分的提取:

新鲜柑橘皮５0ｇ称量，剪成20*２0ｃm细条,加80mL2%的HCl,浸泡０.5小时,抽滤，再加50ml2%盐酸,浸泡0.５h，抽滤,再加50mｌ２%盐酸,浸泡０．5h,抽滤,合并三次滤液,定容到25０mL,移取10mL保存用于原子吸收分析，剩余用于维生素C测定。

（2）维生素C的含量测定

a.Na2S2O3溶液的配制（0.01mol/L）:

称取约0.78９５ｇ的硫代硫酸钠结晶固体于小烧杯内，加少量蒸馏水溶解，定容于２50mｌ容量瓶中，转移到棕色瓶中备用。

b．　I２溶液的配制（0.01mol/L）已配好。

c.碘酸钾标准溶液配制：

差量法准确称取碘酸钾０.1052g,放入碘量瓶中,加20mｌ水,3ｍｌ3ml/L的H２ＳO4和10ml的10%的KＩ,用蒸馏水稀释定容到2５0ｍl。

ｄ．硫代硫酸钠溶液的标定:

用水冲洗碱式滴定管,再用少量硫代硫酸钠溶液润洗,然后加入硫代硫酸钠至0刻度以上,排气;

用移液管移取KIO3标准溶液25.00mＬ,加入3mL　３M的硫酸、１0mL10%碘化钾溶液，用硫代硫酸钠滴定该碘酸钾溶液至浅黄色，加入2ｍL淀粉指示剂，滴定至无色且3０s内不变色；

重复三次上述操作并记录数据;

ｅ.Ｉ2溶液的标定

用移液管移取２5.０0mL）I2溶液到碘量瓶中,用硫代硫酸钠滴定至浅黄色,加入2mL淀粉指示剂，滴定至无色;

ｆ.用标定好的碘溶液滴定样品,将２40ｍｌ的维C提取液倒至锥形瓶中,滴定前加入２mL淀粉指示剂，滴定至淡蓝色。

2、ＡＡS测Zn2+　

（1）标准溶液的配制：

称取0.２981g氧化锌基准物,用６mol/L的HＣl定容至1０0mｌ,稀释100倍后，分别移取0．50mｌ、1．00ｍl、1.５0mｌ、２.００ml、２．50mｌ上述溶液至编号为1-5的50mL容量瓶中，稀释定容后待用。

　（２）工作曲线绘制及样品含量测量:

按浓度重低到高的顺序依次测定1-5号容量瓶中不同浓度标准液的的吸光度并记录数据绘制工作曲线。

标准液测定完毕后，取步骤１中所移取出的10．００mL维C提取液，用尼龙滤网抽滤该维C提取液，抽滤完成后测定其吸光度。

3、橙皮苷的提取和含量测定

（1）乙醇回流提取橙皮苷:

定量2０ｇ橘皮在8０ml乙醇中回流2小时,过滤，用乙醇定容到100ml容量瓶中，备用。

（２）橙皮苷含量的测定：

储备液：

称取０.0989g橙皮苷配制橙皮苷标准液（2mｇ/ml）,用0．1M氢氧化钠：

乙醇=50:

5０,定容到50ｍl容量瓶中。

将储蓄液稀释5倍至0.4mｇ/ml。

标准曲线绘制:

分别精密量取０.５0ml、1.00ml、2.00ｍl、3.0ml、4.０ml的橙皮苷标准储备溶液0.４ｍg/mｌ，用用0.1M氢氧化钠：

乙醇=50：

５0定容到50ml容量瓶中。

用移液管准确移取0.２5mL样品于５0ｍl容量瓶中，用乙醇定容。

（3）将紫外-分光光度计开机预热、设置，将参比液放入比色皿中,调零。

自检，波长范围为22５~400ｎm，扫描速度为快。

基线校准。

打开样品室盖,对移取编号为3的那瓶溶液进行测定,确定最大吸收波长为287.10nm、3６1．９0nｍ，之后按浓度由低到高的顺序,依次测定五个标准品的吸光度并记录数据，最后测定样品的吸光度并记录。

用三号在２0０-700nm内确定最大波长。

在最大波长处分别测定吸光度值，以值（y）为横坐标、橙皮苷的含量（x，mg／m1）为纵坐标作线性回归，得标准曲线。

样品含量的测定:

样品液稀释１00倍,在最大吸收波长处测定吸光度。

4、香精油的提取和分析

（1）水蒸气蒸馏提取橘皮香精油:

称取30g的柑橘皮，剪成细条状,进行水蒸气蒸馏,控制水蒸气蒸馏速度，蒸馏1.５ｈ，收集100-1５０ｍl左右的馏出液，将馏出液转移到分液漏斗中,用30ml氯仿萃取一次后，水层继续用２0ml氯仿萃取一次，合并两次氯仿溶液，加无水硫酸钠至溶液澄清,用氯仿定容到50ml容量瓶中。

（2）气相色谱测定香精油的含量:

先进行色谱条件优化选出最优条件在进行样品及标准液的测定,优化条件为:

①柱温:

恒温180℃保留10ｍiｎ；

②柱温:

６０℃，以3０℃／min的速度升到18０℃,保留0min；

③柱温：

60℃，以1０℃／min的速度升到１8０℃，保留0miｎ；

优化完成后，选择最优条件进行样品的测定，并记录数据。