基因组DNA提取方法Word文档格式.docx
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3）菌体裂解:
加入6μl50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS110μl,20mg/ml的蛋白酶K3μl,50℃作用3h或37℃过夜。
（此时菌液应为透明粘稠液体）4）抽提:
菌液均分到两个1.5mlEP管,加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）,混匀,室温放置5-10min。
12000rpm离心10min。
抽提两次。
（上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去）5）沉淀:
加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。
12000rpm离心10min。
6）洗涤:
沉淀用75%的乙醇洗涤。
7）抽（凉）干后,溶于50μlddH2O中,取2-5μl电泳。
作PCR模板用。
细菌基因组DNA的微量提取法
本方法通过SDS裂解细胞,蛋白酶降解蛋白,CTAB去除多糖成分
一:
仪器:
同方法一
二:
试剂:
TE、TAE缓冲液;
10%SDS;
5MNaCL;
20mg/ml蛋白酶K;
CTAB/NaCL溶液（10%CTAB,0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中,缓慢加入10gCTAB,加热溶解）;
25/24/1,酚/氯仿/异戊醇;
24/1,氯仿/异戊醇;
异丙醇;
70%及100%乙醇
三:
操作
1.5ml对数生长期细菌细胞
离心,5000rpm,1min
沉淀
溶于500μlTE缓冲液中混匀
30μl10%SDS,3μL蛋白酶K,混匀,37℃,1小时
100μlNaCL（5M）混匀
80μl的CTAB/NaCL,*混匀;
65℃10min（可不做）
加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,
离心12000rpm,4-5min
取上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。
注意1,*此步操作后,离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M,否则DNA将与CTAB共沉淀。
2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。
对于菌体样品,通过此流程,?
可以获得较为
完整的DNA分子。
细菌总DNA的提取和鉴定
【目的和要求】
1.学会CTAB法提取细菌总DNA。
2.掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。
【实验原理】
DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的,因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后,必须将其中蛋白质去除。
CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中可溶并且稳定存在,若降低盐浓度,CTAB与核酸的复合物会沉淀出来,而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。
DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。
DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于DNA分子或DNA片断的分子量差别,电泳后呈现迁移位置的差异。
【实验试剂和器材】
（一）试剂:
菌株（E.coli）;
蛋白酶K（20mg/ml）;
琼脂糖;
标准DNA水解液
1.10%SDS
2.酚/氯仿/异戊醇（1/1/1）
3.异丙醇;
70%乙醇
4.LB培养基:
蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g加蒸馏水至1升,然后灭菌备用。
5.TE缓冲液:
10mMTris?
HCl,0.1mMEDTA（pH8.0）。
6.CTAB/NaCl溶液（5%w/v）:
5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中,需要加热到65℃使之溶解,然后室温保存。
7.TAE缓冲液（50×
）（pH8.0）:
每升溶液中含有242gTris,57.1ml冰乙酸,100ml0.5mol/LEDTA。
电泳时稀释成1×
浓度使用。
8.溴酚兰-甘油指示剂:
先配制0.1%溴酚兰水溶液,然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成
9.0.5ug/ml溴乙啶染液:
称取5mg溴乙啶,用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升,最终浓度为0.5ug/ml。
（二）器材:
锥形瓶（250ml）,1.5ml离心管,水浴锅,离心机,电泳槽,电泳仪,摇床,移液枪,洁净工作台,电磁炉,紫外成像仪
【实验方法】
（一）细菌总DNA的提取
1.将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3.沉淀物加入567ul的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h.
4.加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀,再加入80ulCTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。
5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心4-5min,将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。
6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇,在洁净工作台中稍加干燥,重溶于20ulTE缓冲液（含RNaseA﹤25ng/ml）中,准备电泳检测。
（二）琼脂糖凝胶电泳
1.制胶:
称取琼脂糖粉末,置于三角瓶中,加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度,加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中,待溶液温度降至65℃时,立即倒入制胶槽中,插入样品梳。
在室温放置0.5-1h,待凝胶全部凝结后,轻轻拔出样品梳。
然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。
2.加样:
取0.5-1ug左右的样品,体积为10-20ul,加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂,混匀后小心地加到样品槽中。
同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液,在同一凝胶板上进行电泳。
3.电泳:
维持恒压100V,电泳0.5-1h,直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部,停止电泳。
4.染色:
将凝胶取出后浸入0.5mg/ml溴乙啶溶液中,染色0.5-1h。
染液可反复多次使用。
5.观察:
将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。
DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。
【注意事项】
1.溴乙啶有毒,配制和使用溶液时要戴手套,勿将溶液滴洒在台面或地面上。
溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。
2.倒凝胶板时不要太厚,否则影响电泳效果。
细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法综述,提供了5种方法。
1快速微量提取法
A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min,丢去上清夜,收集菌体。
B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。
E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾（3M,pH8.0）,-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;
置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4℃保存备用。
2蛋白酶/SDS法制备
先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体,用WashingTE（50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0）洗菌体2次,之后将菌体充分悬浮在5ml1×
TE缓冲液中,先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS,轻轻混匀后50℃放置3h~5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次后,乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1×
3
1）细菌培养:
细菌接种于5ml液体培养基中,37℃摇床（300rpm）培养过液。
取1ml培养物于1.5mlEP管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1mlTE（pH8.0）中（用ddH2O也行）。
再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS110μl,20mg/ml的蛋白酶K3μl,50℃作用3h或37℃过夜。
（此时菌液应为透明粘稠液体）
4）抽提:
（上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去）
5）沉淀:
4.DNAEXTRACTIONPROCEDURE-GENERAL
1）Growcellsovernightin500mlbrothmedium.
2）Pelletcellsbycentrifugation,andresuspendin5ml50mMTris（pH8.0）,50mMEDTA.
3）Freezecellsuspensionat-20C
4）Add0.5ml250mMTris（pH8.0）,10mg/mllysozymetofrozensuspension,andletthawatroomtemperature.Whenthawed,placeonicefor45min.
5）Add1ml0.5%SDS,50mMTris（pH7.5）,0.4MEDTA,1mg/mlproteinaseK.Placein50Cwaterbath
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