基因编辑检测方法_精品文档资料下载.pdf
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（一）：
Surveyor或T7E1核酸酶分析Surveyor和T7E1核酸酶检测突变后的DNA分子原理类似，两者均可准确切割异源双链DNA错配位点，其中T7E1核酸酶还可切割十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA。
通过PCR扩增野生型和基因编辑后的基因组DNA，扩增出含突变位置的PCR片段，将野生型和突变型PCR产物进行变性退火杂交，再用Surveyor和T7E1核酸酶切割杂交后的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳，则可快速检测出DNA双链是否发生了突变，原理如图一所示。
这种检测方法对核酸酶的编辑效率有一定的限制，编辑效率太低则会导致检测比较困难，其中T7E1核酸酶对缺失突变的DNA片段检测更为有效，而Surveyor对单碱基引起的突变检测更为有效，整体来讲，T7E1检测灵敏度优于Surveyor核酸酶（Vouillot,Thelieetal.2015）。
图一：
Surveyor或T7E1核酸酶分析
（二）：
PCR-RFLP分析聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）是一种常用的检测基因编辑后突变DNA分子，通过PCR扩增编辑后的基因组DNA，获得含突变位点的PCR片段，然后根据突变位点附近特异的限制性内切酶切割PCR片段，通过琼脂糖凝胶电泳分型来检测基因组DNA是否发生突变，原理如图二所示。
这种方法灵敏度较高，检测成本较低，简单易操作，但是其受限于DNA序列上的酶切位点，若突变后的DNA上酶切位点未被破坏，则会漏检突变体。
图二：
PCR-RFLP分析（三）：
高分辨率熔解曲线（HRM）分析高分辨率曲线分析是基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态的熔解曲线的原理进行分析，其在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线来检测突变，熔解曲线取决于DNA序列、长度和GC含量等，可以检测样品突变、单核苷酸多态性和甲基化。
原理如图三所示，该方法检测灵敏度和特异性较高，但细胞中存在的天然SNP位点会干扰对核酸酶造成的DNA突变地判定，且成本较高，需特定地仪器设备。
此方法也已多次成功应用于突变体的检测筛选（Parant,Georgeetal.2009,Thomas,Percivaletal.2014,Samarut,Lissoubaetal.2016）。
图三：
高分辨率熔解曲线分析，引自（Thomas,Percivaletal.2014）（四）：
单链构象多态性（SSCP）分析单链构象多态性分析是利用单链DNA序列中碱基的不同而引起单链DNA构象的改变，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型分析野生型和突变型DNA分子，原理如图四所示。
本方法操作简单，准确率高，PCR片段为200-400bp，突变比例达到10%及以上即可高效检测，不受酶切位点的限制，且适用于大批量样品的检测筛选。
Zheng等（Zheng,Yangetal.2016）运用此方法高效灵敏地检测出经CRISPR/Cas9系统修饰后的水稻突变体植株，在含多种突变类型的水稻原生质体中也同样适用，且Zhou等（Zhou,Dengetal.2017）证实在进行突变体的筛选时，SSCP分析比PCR-RFLP分析更为可靠。
图四：
单链构象多态性分析，引自（Zheng,Yangetal.2016）（五）：
临界退火温度PCR（ACT-PCR）分析临界退火温度PCR（ACT-PCR）分析是基于PCR扩增中引物退火温度的特异性进行突变体筛选。
PCR扩增是生物学中最常用方法之一，一个PCR循环包含三个步骤变性、退火和延伸，其中退火温度是PCR成功与否的关键。
该筛选突变体的方法有三步，第一：
设计包含双链断裂（DSB）处1-4bp的特异性引物，且另一条引物的Tm值要大于此特异引物；
第二：
通过梯度PCR鉴定出特异引物PCR扩增的临界退火温度；
第三：
用临界退火温度PCR快速筛选突变体，原理如图五所示。
Hua等（Hua,Wangetal.2017）运用此方法高效精确地对水稻和斑马鱼进行突变体筛选，此方法操作简单，精确快速，省时省力，成本低，不受酶切位点限制，适用于大批量的突变体筛选。
图五：
临界退火温度PCR分析，引自（Hua,Wangetal.2017）除上述几种检测方法之外，还有一些检测突变体的方法，如微流控毛细管电泳（Chenouard,Brusselleetal.2016），荧光PCR（Ramlee,Yanetal.2015）等。
整体来讲，每种方法各有各自的特点，就如每个人心中都有不同的“吕布貂蝉”，适用于自己的方法才是最好的方法。
参考文献：
Chenouard,V.,L.Brusselle,J.M.Heslan,S.Remy,S.Menoret,C.Usal,L.H.Ouisse,N.G.TH,I.AnegonandL.Tesson（2016）.ARapidandCost-EffectiveMethodforGenotypingGenome-EditedAnimals:
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547.Thomas,H.R.,S.M.Percival,B.K.YoderandJ.M.Parant（2014）.High-throughputgenomeeditingandphenotypingfacilitatedbyhighresolutionmeltingcurveanalysis.PLoSOne9（12）:
e114632.Vouillot,L.,A.ThelieandN.Pollet（2015）.ComparisonofT7E1andsurveyormismatchcleavageassaystodetectmutationstriggeredbyengineerednucleases.G3（Bethesda）5（3）:
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1545-1554.Zhou,J.,K.Deng,Y.Cheng,Z.Zhong,L.Tian,X.Tang,A.Tang,X.Zheng,T.Zhang,Y.QiandY.Zhang（2017）.CRISPR-Cas9BasedGenomeEditingRevealsNewInsightsintoMicroRNAFunctionandRegulationinRice.FrontiersinPlantScience8.
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