生物化学实验Word文档下载推荐.docx

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5H2O）溶于约15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml浓氨水，30ml冰凉的蒸馏水和20ml饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置1－2h，再用蒸馏水定容至100ml后，摇匀备用。

3、器材：

试管，试管架，恒温水浴，722型分光光度计。

四、操作方式

一、标准曲线的绘制：

取l2支干试管分成两组，按下表平行操作。

1

2

3

4

5

标准蛋白质/ml

蛋白浓度mg/ml

蒸馏水/ml

双缩脲试剂/ml

充分摇匀后，室温下（20-25℃）放置30分钟

吸光度（540nm）

取两组测定的A540平均值，以A450为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

二、样品的测定：

取4支试管分成两组，按下表平行操作。

血清稀释液ml

充分摇匀后，室温下（20-25℃）放置30分钟

A450

五、计算：

取两组平均值计算。

血清样品蛋白质含量（g/100ml血清）＝（Y*N）/V×

10－3×

100

固体样品蛋白质含量（%）=（Y*N）/C×

其中：

Y为标准曲线查得蛋白质浓度（mg/ml），N为稀释倍数，V为血清样品所取的体积（ml），c为样品原浓度（mg/ml）。

六、思考题

一、试述分光光度法的大体原理。

二、总结实验进程的要点，你以为要注意哪些问题？

3、比较不一样品的蛋白质含量。

实验二总氮量的测定——凯

氏（Micro—Kjeldahl）定氮法

一、目的

学习凯氏定氮法的原理和操作技术。

二、原理

常常利用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸等）的含氮量。

含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。

此进程通常称为“消化”。

可是，这个反映进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反映液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以增进反映的进行。

甘氨酸的消化进程可表示如下：

CH，NH，C00H+3H2S04—2C02+3S02+4H20+NH。

2NH3+H2S04一（NH4）2SO

浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到必然量、必然浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液巾原来的氢离子浓度为止，最后按照所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。

三、器材

1．50mL消化管或1002．凯氏定氮蒸馏装置或改

mL凯氏烧瓶进型凯氏定氮仪

3．50mL容量瓶4．3mL微量滴定管

5．分析天甲6．烘箱

7．电炉8．1000mL蒸馏烧瓶

9．小玻璃珠10．远红外消煮炉

四、试剂

1．消化液（过氧化氢：

浓硫酸：

水=3：

2：

1）200mL

2．粉末硫酸钾一硫酸铜混合物16g,K2SO4与以3：

1配比研磨混合。

3．30％氢氧化钠溶液1000mL

4．2％硼酸溶液500mL

5．标准盐酸溶液（约0．01mol／L）600mL

6．混合指示剂（田氏指示剂）50mL

由50mL％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0．1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。

这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。

变色范围很窄且灵敏。

7．市售标准面粉和强盛粉各2g

五、操作方式

1．凯氏定氮仪的构造和安装

凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反映管及冷凝器3部份组成。

蒸汽发生器包括电炉及一个1-2L（升）容积的烧瓶。

蒸汽发生器借橡皮管与反映管相连，反映管上端有一个玻璃杯，其上端通过反映室外层与蒸汽发生器相连，下端靠近反映室的底部。

反映室外层下端有一开口，上有一皮管夹，由此可放出冷凝水及反映废液。

反映产生的氨可通过反映室上端细管及冷凝器通到吸收瓶中，反映管及冷凝器之间借磨口连接起来，避免漏气。

安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太近，以避免放不下吸收瓶。

然后将反映管通过磨口连接与冷凝器相连，按照仪器本身的角度将反映管固定在另一铁支台上。

这一点务须注意，不然容易引发氨的散失及反映室上端弯管折断。

然后将蒸汽发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反映管连接起来。

安装完毕后，不得轻易移动，以避免仪器损坏。

2．样品处置

某一固体样品中的含氮量是用lOOg该物质（于重）中所含氮的g数来表示（％）。

因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。

一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。

在称量瓶中称入必然量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。

用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。

每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。

若样品为液体（如血清等），可取必然体积样品直接消化测定。

精准称取O1g左右的干燥面粉作为本实验的样品。

3．消化

取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。

各加1颗玻璃珠，在l及2号瓶中各加样品，催化剂（K2S04一CuS04·

5HO）200mg，消化液5mL。

注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。

在3及4号瓶中各加mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。

每一个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。

在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。

待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出,S02白烟后，适当增强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。

消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL（注意慢加，随加随摇）。

冷却后将瓶中溶物倾入50mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。

用水稀释到刻度，混匀备用。

4．蒸馏

（1）蒸馏器的洗涤蒸汽发生器中盛有效几滴硫酸酸化的蒸馏水。

关闭皮管夹，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。

约15分钟后，在冷凝器下端放一个盛有5mL2％硼酸溶液和1～2滴指示剂混合液的锥形瓶。

位置倾斜如图所示，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤1～2分钟，观察锥形瓶内的溶液是不是变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。

向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1分钟。

用水冲洗冷凝管口后用手捏紧橡皮管。

此时由于反映室外层蒸汽冷缩，压力减低，反映室内凝结的水可自动吸出进入反映室外层。

最后打开皮管夹，将废水排出。

（2）蒸馏取50mL锥形瓶数个，各加5mL硼酸和1～2滴指示剂，溶液呈紫色，用表面皿覆盖备用。

用吸管取10mL消化液，细心地由蒸馏器小玻杯注入反映室，塞紧棒状玻塞。

将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器F端浸没在液体内。

用量筒取30％的氢氧化钠溶液10mL放人小玻璃杯，轻提棒状玻璃塞使之流人反映室（为了避免冷凝管倒吸，液体流入反映室必需缓慢）。

尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5mL。

再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流人反映室，一半留在玻璃杯中作水封。

加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧皮管夹，开始蒸馏。

此时锥形瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。

自变色时起记时，蒸馏3～5分钟。

移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面。

继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。

蒸馏完毕后，须将反映室洗涤干净。

在小玻璃杯中倒人蒸馏水，待蒸汽很足、反映室外层温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流人反映室，同时当即用另一只手捏紧橡皮管。

则反映室外层内蒸汽冷缩，可将反映室中残液自动吸出，再用蒸馏水自玻璃杯倒入反映室，重复上述操作。

如此冲洗儿次后，将皮管夹打开，将反映室外层中废液排出。

再继续下一个蒸馏操作。

待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。

（3）滴定全数蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中搜集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。

（4）计算

C（V1–V2）×

×

100消化液总量（ml）

总氮量=------------------------×

-------------------------×

%

W测按时消化液用量（ml）

c为标准盐酸溶液摩尔浓度；

V1滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；

V2滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；

w为样品重量（g）。

14为氮的相对量子质量。

若测定的样品含氮部份只是蛋白质，则，

样品中蛋白质含量（％）=总氮量×

若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。

蛋白氮：

总氮一非蛋白氮

蛋白质含量（g％）=蛋白氮×

625

思考题

1、何为消化？

如何判断消化终点？

2、在实验中加入H2SO4、K2SO4、CuSO4各有什么作用？

3、蒸馏时冷凝管下端为何要浸没在液体中？

4、如何证明蒸馏器洗涤干净？

5、固体样品为何要烘干？

实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。

醋酸纤维薄膜电泳足用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方式。

醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120t~-m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清楚，没有吸附现象等长处。

目前已普遍用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。

1．醋酸纤维薄膜（2~8cm）2．常压电泳仪

3．点样器（市售或自制）4．培育皿（染色及漂洗用）

5．粗滤纸6．玻璃板

7．竹镊8．白磁反映板

1．巴比妥缓冲液（pH8．6，离子强度0．07）1000mL

巴比妥2．76g，巴比妥钠15．45g，加水至1000mL。

2．染色液300mL

含氨基黑10B0．25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL（可重复利用）。

3．漂洗液2000mL

含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL。

4．透明液300mL

含无水乙醇7份，冰醋酸3份。

五、操作

1．浸泡用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。

2．点样把膜条从缓冲液中掏出，夹在两层粗滤纸内吸于多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在放置在白磁反映板上的血清中沾一下，再在膜条一端2～3cm处轻轻地水平地落下并随