生物活性小分子与靶点相互作用研究中的新方法和新技术Word下载.docx

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活性小分子与靶蛋白的相互作用是生命中基本的相互作用之一,因而靶蛋白和活性小分子的筛选是生命有机化学及药物化学研究的重要内容.在活性小分子筛选方面,细胞印迹（cytoblot）、以核磁共振为基础的结构活性关系研究（SAR-by-NMR）及反双杂交（reversetwo-hybrid）系统分别是以细胞、靶蛋白及蛋白间的相互作用为靶点的高通量、快速的筛选方法.另外,在由活性小分子鉴定靶蛋白的研究中,三杂交（three-hybrid）系统、功能表达克隆（functionalexpression-cloning）及药物印迹（drug-western）等方法大大加速了靶蛋白的鉴定进程;

而展示克隆（displaycloning）方法可以直接完成由活性小分子到靶蛋白基因的克隆.结合DNA芯片技术,以基因组为基础的筛选方法同时还可以明确小分子参与的一系列生物大分子调控.而小分子印迹（smallmolecularprinting）是从组合化学出发适应人类基因组要求的筛选靶蛋白及活性小分子、研究小分子参与调控的方法.概要介绍这几种最新筛选方法,并对中草药现代化进行了初步探讨. 

关键词 

靶蛋白活性小分子筛选细胞印迹SAR-by-NMR反双杂交三杂交功能表达克隆药物印迹展示克隆小分子印迹化学基因学中草药现代化

　　20世纪90年代,随着分子生物学和有机化学的飞速发展,人类基因组计划的全面展开,越来越多的有机化学家尝试通过活性有机小分子来探索生物大分子的功能及调控,从而从分子及化学键的水平揭示生命活动的本质.于是一门融合了化学及生物学的交叉学科棗化学生物学应运而生.与此同时,随着人类基因组学及蛋白组学的发展,以活性有机小分子为探针来研究基因表达及细胞周期调控的化学基因学（chemicalgenetics）[1～4]正逐步形成.在这些研究中,从生物活性小分子出发寻找它们的生物靶分子,或从生物靶蛋白出发寻找高亲和性配体分子,是当前研究活性小分子与生物靶分子相互作用、分子识别、信息传递、生命过程的小分子调控机制及发现新颖药物的关键环节.最近这一领域出现了一系列新概念、新方法和新技术,如细胞印迹,SAR-by-NMR,反双杂交技术,三杂交系统,功能表达克隆,药物印迹,展示克隆,DNA芯片技术及小分子印迹等.本文结合化学基因学,主要介绍这几种最新筛选方法的原理、特点及在发现活性小分子和靶蛋白方面的应用.

　　1活性小分子的筛选

　　有机化学,特别是组合化学可以方便地创造数量极其庞大的小分子化合物库,但是以往如何从这庞大的化合物库中筛选到期望的活性分子却面临很大的困难,缺少灵敏、有效且可快速筛选的方法及手段是当时的主要障碍.下面介绍的最近发展的几种高通量、快速而灵敏的筛选活性小分子的方法也许是对克服上述困难的有益的探索. 

　　1.1 

高通量活性小分子的筛选棗细胞印迹

　　细胞印迹（cytoblot）[5],即高通量整细胞免疫检测（high-throughputwhole-cellimmunodetec-tionassay）,是在酶偶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（westernblotting）的基础上发展起来的.该方法用于快速检测小分子对DNA合成、蛋白翻译后加工（乙酰化、磷酸化等）及细胞周期等的影响.其基本原理与免疫印迹十分类似（图1）,但是检测某一类细胞中的分子是在多孔培养板上的整细胞水平进行的.首先以待检测的分子作为抗原制备抗体,即一抗;

然后选择合适的二抗进行检测,如采用联有辣根过氧化酶的二抗与一抗偶联,形成的复合物通过加入氨基苯二酰一肼（luminol）、过氧化氢和对碘苯酚进行检测.若细胞中有待检测的分子（即抗原）存在,则引发的化学发光反应使底片感光;

若不存在,则无发光反应.5-溴尿嘧啶是一种化学诱变剂,在DNA复制过程中,它的渗入可使原来的A-T配对转变为G-C配对,从而导致癌变.凡是可以阻止5-溴尿嘧啶渗入的化合物在一定程度上具有抗癌作用.Stockwell等人[5]采用细胞印迹法在6144孔细胞培养板上验证了已知的抗癌药如转化生长因子-β（transforminggrowthfactorβ）、噻氨酯哒唑（nocodazole）等阻止5-溴尿嘧啶渗入DNA合成的情况,以此建立了细胞印迹筛选活性小分子的方法.其最大的优点是能够进行活性小分子的高通量快速筛选,可以采用组织特异的细胞在纳升到毫升的规模培养.但该方法一般适合于初筛,要进一步明确所得小分子的活性还需结合其他筛选方法.

图1细胞印迹原理示意图

　　核仁素（nucleolin）是细胞核仁中的一种蛋白,当细胞进入有丝分裂时核仁素被特异地磷酸化,而可以抑制有丝分裂的小分子化合物均可以增加磷酸化核仁素的含量.最近为了寻找不与微管蛋白相互作用的有丝分裂抑制剂,Mayer和Haggarty等人[6,7]以磷酸化核仁素为抗原制备一抗,采用细胞印迹法从合成的16320种化合物中筛选到139种化合物可以阻止细胞分裂（图2）.然后,采用体外微管蛋白的聚合检测,排除其中53个与微管蛋白相互作用的分子得到了86个化合物.进一步采用体内染色体和微管染色检测等方法筛选到一种通过阻止纺锤体形成而抑制细胞有丝分裂的活性化合物Monastrol（图2）,在该化合物的作用下正常纺锤体被星状单极化.结合他们及其他实验室工作的积累,进一步推断该化合物很可能至少作用于有丝分裂驱动蛋白（mitotickinesin）Eg5.该活性分子作用机制完全不同于目前广泛研究的紫杉醇等作用于微管蛋白而抑制有丝分裂的抗癌药,其靶蛋白的确定为进一步合成、筛选Monastrol的高活性类似物提供了筛选模型,因此完全有可能发展成一类像紫杉醇一样有效但不具有神经毒性、细胞毒性等副作用的新型抗癌药[8].同时,从该化合物的筛选到作用机理的阐明及靶蛋白的鉴定首次提供了一种完全在实验室中从有机化学和生物学的角度开发新药的新思路[9,10].

图2多步筛选获得新活性化合物Monastrol

　　1.2 

以靶蛋白为模型筛选小分子配体棗SAR-by-NMRTM

图3SAR-by-NMR原理示意图

　　在明确与疾病相关的靶蛋白的基础上,人们利用现代生物工程结合NMR技术,发展了一种新的具有一定导向性的快速发现生物大分子高亲和性配体的方法棗SAR-by-NMRTM[11,12] 

（structure-activityrelationshipbynuclearmagneticresonance）.该方法结合了合理性设计中的配体设计和优化方法和非合理性设计（如组合化学）的合理因素,大大地提高了先导化合物发现的速度和有效性.其基本过程包括5个步骤（图3）[12]:

（1）采用基因工程方法制备15N标记的靶蛋白,通过二维NMR技术从某一小分子化合物库中筛选出和靶蛋白结合的第1个先导小分子.

（2）对该分子的类似物进行筛选,通过结构与活性的关系（SAR）对其进行优化.（3）采用与第1步相同的方法筛选出与前一结合亚位点相邻的亚位点结合的第2个先导分子.（4）对第2个先导分子的类似物进行筛选,得到第2个优化的先导分子.在选定两个先导分子片段之后,用多维NMR 

[13,14]等技术测定蛋白质和两个配体的复合物的完整三维空间结构,确定两个配体在靶蛋白上确切的结合位置及其空间取向.（5）基于上述三维结构设计恰当的连接桥将两个先导分子连接起来,使得到的分子和靶蛋白结合时保持各自独立时的结合位置及其空间取向,最终筛选得到一个高亲和性的配体.由于采用NMR技术可以综合多种药物设计的优势,能够在短时间内得到先导化合物,而且在溶液中检测的是小分子与靶蛋白相互作用的真实情况,因而大大加快了药物发现的速度.到目前为止采用该方法已成功地发现了FK506结合蛋白的高亲和性配体[12]、溶基质素的非肽抑制剂[15]、人乳头状病毒（papillomavirus）E2蛋白的抑制剂[16]SH结构域的高亲和性配体[17]及rRNA甲基转移酶ErmAM的抑制剂[18]等.最近的研究表明,采用低温核磁共振探测技术[19],SAR-by-NMR可用于活性小分子的快速、高通量筛选. 

　　1.3 

利用靶蛋白-蛋白相互作用筛选活性小分子棗反双杂交系统

图4反双杂交系统筛选活性小分子原理示意图

图中右侧酵母生长情况的阴影斑代表酵母细胞正常生长,空白斑代表酵母细胞没有生长或非正常生长.DB代表DNA结合蛋白;

AD代表活化蛋白结构域

　　蛋白-蛋白的相互作用是生命活动中广泛而重要的相互作用,与许多疾病相关,因此以蛋白-蛋白的相互作用为靶体筛选活性小分子是药物筛选的另一重要途径[3,20].酵母双杂交技术是研究蛋白与蛋白（或多肽）间相互作用的常用技术[21～23],而最近由此发展的反双杂交系统（reversetwo-hybridsystem）就是利用蛋白-蛋白的相互作用为靶体在细胞水平上来筛选活性小分子的高通量筛选方法.酵母双杂交技术的基本原理是融合于DNA结合域（DB）的蛋白X与融合于转录活化域（AD）的蛋白Y的相互作用导致BD与AD空间上的接近,从而激活报告基因的转录及表达.反双杂交基本原理与酵母双杂交技术相似（图4）,只是报告基因所导致的细胞生长表型正好相反,即只有在X与Y不发生相互作用的情况下报告基因不被启动,细胞才能生长.当采用与疾病有关的一对可发生相互作用的蛋白作为X与Y,采用反双杂交系统来筛选活性小分子时,若小分子有活性,抑制了X与Y的相互作用,报告基因不被转录,细胞正常生长;

若待筛选小分子无活性,不影响X与Y的相互作用,这时启动报告基因的转录,产生的蛋白分解培养基中的某一特定化合物产生细胞毒性（如URA3[24]分解5-氟乳清酸,5-fluoro-oroticacid）,酵母细胞就不能生长.将转移生长因子-β-I受体作为反双杂交系统中的X融合到DB上,FK506结合蛋白12（FKBP12）作为Y融合到AD上[25],采用该系统可以检测到FK506的活

　　性[3,25,26].最近,Young等[27]采用N型钙离子通道亚基间相互作用建立的反双杂交系统对156000个合成的化合物库进行了系统的筛选,获得了一个较好的抑制N型钙离子通道的活性小分子,它有可能发展成一类新型的、有潜在治疗意义的钙离子通道拮抗剂.

　　由于该方法在细胞水平筛选,因此小分子的通透性及细胞毒性同时在筛选的内容之列.但正是由于这一点,像其他细胞水平的筛选方法一样,小分子通透性往往影响其活性的检测,同时样品的用量也较大.尽管蛋白-蛋白的相互作用在各种疾病中起重要作用,但目前以此为模型筛选活性小分子还未得到广泛的应用[3].反双杂交系统在观念上完全适应高通量快速筛选的需要,随着人类基因组学及蛋白质组学研究的进展,越来越多的与疾病相关的蛋白间相互作用的阐明必将促进反双杂交系统在活性小分子筛选中的推广与发展.

　　2靶蛋白的鉴定

　　到目前为止,大约每1000个人体蛋白中只有一个成为药物筛选的靶蛋白.现在90%以上的新药是由大量化合物通过这些靶蛋白的筛选而获得的.据估计,人体至少应有200000个蛋白可以作为药物筛选的靶蛋白[2].特别是进入后基因组时代,大量的靶蛋白易于得到,但如何确定其活性或功能仍是利用其进行药物筛选的前提.因此,寻找和确定与疾病相关的靶蛋白,进而利用这些靶蛋白来筛选新的活性