临床试验SOP 第四节仪器操作类SOP 的撰写指南文档格式.docx
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15.WD-21D型生化分析仪标准操作规程,等等。
以上只举出临床试验过程中的部分仪器操作类SOPs。
实际上,对药物临床试验机构来讲,涉及到的仪器设备远远不止这些。
而且,同种仪器设备也可能由于不同厂家生产、或型号规格不同使得制定SOP的数量倍增,因此很难说这类SOP究竟多少份就足够。
二编写要点
由于仪器操作类SOPs包括内容广泛,种类繁多,而且各具特色,所以在撰写此类SOP时特别需要根据每个仪器操作程序、环节的不同特点来进行编写。
流程图可简明、清晰地传达信息,故程序性较强的环节可考虑用流程图来描述。
仪器操作类SOPs要注意其内容在排序上与实际操作一致,以保证其可行性。
在仪器操作类SOPs中除了正确的操作程序外,还应建立质量保证体系。
该体系包括适当的维护、检测和校准程序保证各仪器处于正常运行状态。
在一些临床药代动力学的研究,如生物样本浓度测定中,还使用各种方法学确证手段和质控样品,来保证实验方法和结果的准确、可靠。
(一)范例1:
高效液相色谱仪测定西肽普兰的标准操作规程
SOP编号:
页数:
制订人:
审核人:
批准人:
(签名、日期)(签名、日期)(签名、日期)
颁发日期:
生效日期:
修订登记:
编号
页码
修订内容
修订原因、依据
修订人
签名/日期
批准人
审查登记:
审查日期
签名
1
4
2
5
3
6
Ⅰ.目的:
此SOP的目的是定量和定性测定人血浆中西肽普兰浓度
Ⅱ.范围:
适用于西肽普兰的临床药代动力学研究
Ⅲ.规程:
1.标准品:
氢溴酸西酞普兰对照品(批号:
030902,纯度:
%,汕头XX制药总厂),盐酸普萘洛尔(批号:
030604,纯度:
%,汕头XX制药总厂)。
2.试剂
2.1乙腈:
色谱纯试剂(Merk,德国);
2.2其它试剂:
为分析纯试剂。
三乙胺(分析纯,XX永生试剂厂),磷酸二氢钾(分析纯,广州化学试剂厂);
氢氧化钠(分析纯,广州市东红化工厂);
盐酸(分析纯,广州化学试剂厂);
正己烷(分析纯,广州化学试剂厂);
异戊醇(分析纯,广州化学试剂厂);
2.3水:
去离子水,再用Millipore超纯水系统进行纯化,滤膜孔径为0.2μm。
3.仪器设备
3.1Waters高效液相色谱系统(600E低压梯度泵,717自动进样器,474荧光检测器,Mellenium32色谱工作站);
3.2XW-80A漩涡混合器(XX医科大学仪器厂);
Sigma冷冻离心机;
高速离心机(美国雅培公司血药浓度监测仪附件)。
1.0溶液制备
4.1标准溶液配制
4.1.1精密称取西酞普兰标准品10.0mg,置于100mL容量瓶,以甲醇溶解并定容,得100µ
g/mL的西酞普兰储备液;
4.1.2取西酞普兰储备液25、50、75、100、250、500、1000µ
L,分别置于100mL容量瓶,以甲醇稀释并定容,配制浓度分别为25﹑50﹑75、100、250、500、1000ng/mL的西酞普兰标准溶液。
4.2内标液的配制
4.2.1精密称取普萘洛尔0.4mg置于100mL容量瓶,以甲醇溶解并定容,得浓度为4µ
g/mL的内标液。
4.3流动相配制
4.3.1精密称取4.08gKH2PO4,溶于950mL蒸馏水,混匀后备用;
4.3.2用移液器量取0.1mL三乙胺置于100mL容量瓶,加95mL蒸馏水手动混匀,再加蒸馏水至刻度,混匀后备用;
4.3.3用%三乙胺调KH2PO4溶液pH到,并用蒸馏水稀释到1000mL,混匀;
4.3.4各取的KH2PO4溶液6份和乙腈4份混合,尼龙膜过滤脱气后备用;
4.3.5注:
实际量取的KH2PO4溶液和乙腈体积必须在实验记录本上予以记录。
4.40.2MNaOH溶液的配制
4.4.1精密称取0.8gNaOH,置于100mL容量瓶,用蒸馏水溶解并定容,混匀后备用。
4.50.01MHCl溶液的配制
4.5.1精密量取84µ
L37%的浓HCl,加入95mL蒸馏水(100mL容量瓶),再用蒸馏水定容,混匀后备用。
4.6正己烷-异戊醇(98∶2,v/v)溶液的配制
4.6.1分别量取980mL正己烷和20mL异戊醇,置于1000mL玻瓶,混匀后备用。
5.1加样血浆样品的配制
5.1将10µ
L的25﹑50﹑75、100、250、500、1000、5000、10000ng/mL西酞普兰标准溶液加入1mL空白血浆,漩涡混合30s,配置成、、0.75、1、、5、10、50、100ng/mL的西酞普兰标准血浆溶液备用。
6.1样本提取过程
6.1取血浆样品1mL置10mL玻璃试管中,准确加入内标溶液(普萘洛尔4µ
g/mL)25µ
L,漩涡混合30s;
6.2加入0.2MNaOH溶液500µ
6.3加入正己烷-异戊醇(98∶2,v/v)溶液4mL,漩涡混合2min,离心(4500rpm)10min;
6.4分离有机层转移至10mL尖底玻璃试管中,加入0.01MHCl溶液200µ
L,漩涡混合2min,离心(4500rpm)5min;
6.5弃去上层有机相,吸取下层水相100µ
L进样,记录色谱图。
7.1色谱条件
7.1色谱柱:
×
250mm),色谱科公司,或其它C18柱
7.2保护柱:
在线过滤器
7.3流动相:
乙腈-30mMKH2PO4缓冲液(用%三乙胺调pH到)=40∶60(v/v)
7.4流速:
1.3mL/min
7.5柱温:
室温
7.6荧光检测器
激发波长:
236nm,发射波长:
306nm
7.7自动进样器参数:
进样体积为100μL
7.8数据收集时间:
15min
8.1仪器设置和平衡
8.2仪器设置和平衡
8.1.1开机:
打开高效液相色谱仪各系统电源,确认各系统运行正常;
8.1.2冲洗色谱柱:
按以下顺序冲洗:
50/50的水/乙腈冲洗15min,10/90的水/乙腈冲洗15min,50/50的水/乙腈冲洗15min,90/10的水/乙腈冲洗15min;
8.1.3用流动相平衡色谱柱。
8.3样品分析
8.2.1上样:
将待分析的样品转移到自动进样器样品管,标准血浆样品和质控样品必须均匀分布到未知待测样品中;
8.2.2在开始和结束时各进一次标准品,样品量多时,还须在中间进一次标准品;
8.2.3色谱工作站软件的设置和使用SOP另述。
8.4关机
8.3.1.冲洗色谱柱:
分析结束后按以下顺序冲洗:
90/10的水/乙腈冲洗30min,50/50的水/乙腈冲洗15min,10/90的水/乙腈冲洗30min,50/50的水/乙腈冲洗15min,色谱柱在50/50的水/乙腈条件保存;
8.3.2.关机:
关闭电源。
9.1数据分析
9.1样品和内标峰的确定:
根据标准品的保留时间确定样品和内标峰。
保留时间的变异为1min;
9.2浓度计算
9.2.1用峰面积定量,峰面积由色谱软件自动计算,并由人工进行检查和调整峰面积计算的起始点;
9.2.2样品浓度由分析者根据标准曲线进行计算。
9.3保存每一个色谱图,并按要求打印部分或全部色谱图;
9.4典型色谱图在该SOP的结尾。
10.1方法学确证
10.1特异性(Specificity)
10.1.1特异性是指样品中存在干扰成分的情况下,分析方法能够准确、专一地测定西酞普兰的能力
10.1.2至少要考察6个不同个体空白血浆样品色谱图、空白血浆样品外加对照物质色谱图(注明浓度)及用药后的血浆样品色谱图反映分析方法的特异性。
西酞普兰与内标分离良好,西酞普兰和内标的保留时间分别为和见图1。
图1西酞普兰的HPLC色谱图
A-空白血浆色谱图;
B-空白血浆+标准品色谱图;
B-血浆样品色谱图
1-内标;
2-西酞普兰
10.2标准曲线和定量范围(CalibrationCurve)
10.2.1标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系,一般用回归分析方法(如用加权最小二乘法)所得的回归方程来评价;
10.2.2应提供标准曲线的线性方程和相关系数,其线性相关程度应。
标准曲线高低浓度范围为定量范围,在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度;
10.2.3必须至少用6个浓度建立标准曲线;
10.2.4定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围,不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度;
10.2.5建立标准曲线时应随行空白生物样品,但计算时不包括该点,仅用于评价干扰;
10.2.6标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差(偏差=[(实测值-标示值)/标示值]×
100%)在可接受的范围之内时,可判定标准曲线合格。
可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±
20%以内,其余浓度点的偏差在±
15%以内。
只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算;
10.2.7当线性范围较宽的时候,推荐采用加权的方法对标准曲线进行计算,以使低浓度点计算得比较准确。
10.2.8西酞普兰的标准曲线(0.5~100ng/mL)为:
,,以信噪比S/N=3∶1计,最低检测浓度为0.5ng/mL。
10.3定量下限(LowerLimitofquantitation,LLOQ)
定量下限是标准曲线上的最低浓度点,表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。
其准确度应在真实浓度的80%~120%范围内,相对标准差(RSD)应小于20%。
应由至少5个标准样品测试结果证明。
西酞普兰的定量下限为0.5ng/mL。
10.4精密度与准确度(PrcisionandAccuracy)
10.4.1精密度是指在确定的分析条件下,相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。
通常用质控样品的批内和批间RSD来考察方法的精确度。
一般RSD应小于15%,在LLOQ附近RSD应小于20%。
选择高(70ng/mL)、中(30ng/mL)、低(2.5ng/mL)3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度考察,批间精密度为连续考察5天的结果。
西酞普兰的批内精密度和批间精密度见表1;
10.4.2准确度是指在确定的分析条件下,测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度(即质控样品的实测浓度与真实浓