电化学活性微生物的来源特征及其应用研究微生物论文生物学论文Word格式.docx

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近年来，MFC的输出功率已提高3～4个数量级［4，6，7］。

在MFC的研究中，对用于阳极的产电微生物研究较为集中，富集在阳极上的电化学活性微生物将有机物氧化用于代谢过程中，产生的电子经过外电路传递给阴极，在阴极与电子受体结合，这些氧化还原反应使产生的电子不断传递并在外电路中形成电流［8，9］。

在目前的报道中，MFC阳极中用于产生电流的微生物有几种名词，如电化学活性微生物、胞外产电菌及阳极呼吸菌（Electrochemicallyactivebacteria，exoelectrogenicbacteriaandanoderespiringbac-teria）等。

电极表面性质和结构影响细菌的产电机理和产电能力，本文中统称这类产电的微生物为电化学活性微生物。

由于各物质在电极上发生反应时表现出各自不同的电化学活性特征，以及不同产电微生物与电极间表现出电子传递特征的差异性［10］，目前发现的微生物与电极间电子传递主要有纳米导线［2］、细胞外膜蛋白［11］及利用微生物自生中介体或外加中介体［12］3种方式，完成微生物与电极间的电子转移。

但常常几种方式同时作用，如图1所示。

　　这类电化学活性微生物在利用电子给体进行氧化的过程中，不同的微生物对于电子给体用于自身细胞物质的合成与用于产电的比率是不相同的;

同一种微生物对不同电子给体的作用也是不同的。

如有些微生物能将绝大多数电子给体氧化而用于产电，最高比率可达90%以上，有些微生物则将大部分有机物用于同化过程而只氧化少部分电子给体（40%以下），可见电化学活性微生物在电极表面的催化活性是直接与菌种本身对底物利用的特性相关。

因此，了解各产电微生物的生理生化特性、筛选优势的产电微生物及分析不同菌种间的协同作用，对于进一步深入揭示微生物在阳极表面的电子传递机制及提高电化学催化能力为加速微生物燃料电池的实际应用具有重要意义。

　　2电化学活性微生物的来源、富集、分离及鉴定

　　有关电化学活性微生物在MFC中的研究主要有混合菌及纯菌种两类，纯菌种不但底物来源较窄而且操作要求非常严格，混合菌除了具有从周围环境中容易获得及对环境条件容易适应外，同时在操作上具有相对简单的特点，尤其是对底物的选择更加广泛，所以电化学活性混合菌在实际应用中表现出更加独特的优势。

从环境中进行电化学活性微生物的富集培养可采用三电极体系的半电池装置或应用MFC装置体系，或者直接先筛选铁还原菌，再从中进一步筛选具有铁还原性的电化学活性微生物。

另一方面，为更清晰地研究电化学活性微生物的具体产电机理，需要对群落中的优势菌株进行分离纯化，分离纯化后的菌株可作为理论模型菌利用其降解代谢的具体途径去探索其内部的产电机理。

　　2．1电化学活性微生物来源、富集及群落特征

　　环境中存在着大量电化学活性微生物，广泛分布在工业废水包括乳业的粪肥、制作啤酒的废水、海底沉积物、厌氧活性污泥等自然环境中。

目前，已有研究以厌氧颗粒污泥、消化污泥、生活污水以及牛胃液等作为接种源，成功启动微生物燃料电池，得到的电化学活性微生物群落表现出不同的群落特征及不同的产电能力。

对于从不同来源和不同富集条件富集而来的微生物在种类、群落及产电能力上存在着很大差异。

乙酸盐作为厌氧环境中含量最多最简单的有机酸，是MFC中最常用的底物，在以乙酸钠为底物富集到的MFC微生物群落中变形菌门（Proteobacteria）占多数，其部分为地杆菌属，地杆菌是阳极电化学活性微生物群落中的主要微生物［13］。

另外，以不同有机酸为底物时，MFC的库伦效率明显不同，如醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐为底物时，库仑效率分别为72．3%，36．0%和43．0%［14］。

葡萄糖也是MFC中常用底物之一，其中从美国OysterBay的厌氧沉积物中富集分离到的Ｒ．ferrireducens能直接将葡萄糖氧化为二氧化碳，但对大多数微生物而言，在以葡萄糖作为底物的MFC中，不同微生物降解葡萄糖时会产生不同种类的副产物，副产物对电池的功率密度和库仑效率也有影响，从而导致阳极上的电化学活性微生物种类也具有多样性。

复杂有机物纤维素在自然界中普遍存在，已有利用瘤胃微生物作阳极生物催化剂与周期性添加纤维素作为底物成功使MFC运行2个多月的先例，其中Clostridiumspp．是附着生长的优势菌，当加入不同的底物时，所富集到的菌种也是不同的［15］。

而在Ｒezaei等［16］设计的U形管MFC，同样以瘤胃微生物和纤维素分别为催化剂和为底物，分离到的可以利用纤维素产电的微生物是Enterobactercloacae。

同样，从海底沉积物中及从河水中直接富集到的菌群中也有很大差别［13，17］。

可见，所富集的菌群组成特征依赖于菌群的来源及富集环境。

　　对菌落的分析可采用传统的Sanger测序技术，但针对该技术检测通量低和检测灵敏度不高等问题，已有研究者采用其它联用技术提高测试性能。

例如DGGE方法，具有可靠、可重复、快速等特点，已成为分析微生物群落的多样性及动态变化的重要工具，为目前分析MFC中微生物群落结构的常用方法［18］。

基因文库分析法也是常用的分子生物学分析技术，进行16SrDNA克隆文库构建，获取更为精细的微生物群落结构，进而获得特定环境中的细菌群落结构和细菌多样性信息。

通过构建16SrDNA克隆文库，已经取得以厌氧污泥为接种源，，并以麦秸为底物而富集的电化学活性微生物群落结构［18］。

近来对菌落的群落分析出现了更为先进的高通量测序技术，该方法可以更加准确地对微生物群落进行分析，已逐渐成为目前研究微生物种群最先进的分子生物学技术。

该方法已多次用于分析MFC中所利用的电化学活性微生物群落结构特征［19］。

　　2．2电化学活性微生物菌种的分离与鉴定

　　对于表现出电化学活性的微生物群落可以进一步进行单一菌种的分离和鉴定工作，目前分离电化学活性微生物主要的应用方法有:

稀释涂布平板法［20］、生物激光印刷法（BioLP）［21］、U形管式的减绝-稀释培养法（Dilution-to-extinction）［22］等。

　　分离纯菌种的经典的稀释涂布平板方法可用于从三电极电化学体系或MFC装置富集到的群落中进行具有电化学活性的纯菌种的分离。

该方法简单，易于操作，但由于这种方法很难直接用于从总菌落的稀释液中寻找产电菌，所以对于分离电化学活性菌有一定的困难。

但是若分离具有铁还原能力的产电菌，可采取在培养基中加入柠檬酸铁，筛选需要Fe（Ⅲ）进行生长的电化学活性微生物，淘汰不具铁还原能力的菌种，进而提高选择到具有铁还原能力的电化学活性菌的机率。

平板划线分离法与稀释平板法相比，操作较简单，但直接应用也存在对产电菌没有选择性的问题。

减绝-稀释法的U型管法是最近发现的一种新的分离电化学活性菌的有效方法［23］，具体过程是采用一个直型和一个弯曲型玻璃厌氧管分别作阳极和阴极室，将从电极收集的混合菌连续稀释后，重新接入MFC中，混合菌体在稀释到一定倍数时，群落中的劣势电化学活性菌种会被淘汰，从而使其中优势菌种在电极上得到单一培养，这样使分离到单一优势菌成为可能。

这种方法避免了传统分离方法的冗长过程，对得到具有优势的电化学活性菌简单有效。

该方法是根据菌株的电化学活性能力，而不是还原铁的能力将不同菌株分离，所以可以克服采用铁还原筛选法中丢失无还原铁能力的电化学活性菌的问题［24］。

　　对于直接分离得到的菌株，可采用16SrDNA方法进行微生物物种鉴定，通过对细菌基因组中的16SrDNA进行克隆测序，最后在Genbank数据库中进行核酸序列比对及大量的生理生化实验进行细菌鉴定。

近年来，科研者分离出的具有电化学活性和产电功能的微生物种类很广，包括原核细菌、绿藻及真核酵母菌［25］。

但是，总的来说目前已发现的电化学活性菌的种类还很有限，对这些微生物与电极间电子转移机理的认识还需要做更深入的工作。

　　3电化学活性微生物的特征及产电能力

　　目前，从微生物燃料电池中分离出的电化学活性微生物主要以细菌为主，分别为变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门（见表1）。

变形菌门是目前研究中发现电化学活性微生物最多的一门，且发现绝大多数产电菌为异化金属还原菌，并且多数为革兰氏阴性菌，其中兼性厌氧菌和严格厌氧菌偏多。

Shewanella和Geobacter是最早研究和研究得较多的两个属，常用来作为研究微生物与电极间电子机理的模式菌。

　　此外，真菌门的酵母菌也发现具有产电能力。

第一个发现的不需添加介体的产电的微生物是异化Fe还原菌Shewanellaputrefaciens［45］，属-变形菌纲，但S．putrefaciens不能将底物彻底氧化，而能与电极间直接进行电子转移的-变形菌纲中的G．sulfurreducens可将醋酸钠彻底氧化为二氧化碳［13］。

对Fe?

的还原能力及对氧的耐受性常常是菌种的主要特征，已发现的电化学活性微生物按其对Fe?

的还原能力可分为严格厌氧、兼性厌氧及专性好氧的异化铁还原菌或非异化铁还原菌5类，下面分别简述这几类主要电化学活性菌的生理生化及产电特征。

　　3．1严格厌氧铁还原菌

　　铁元素是地壳中含量第四高的元素，与生物地球化学循环及土壤中许多重要元素转化密切相关，它对促进土壤物质循环具有重大的环境意义，其中铁还原微生物在元素的生物地球化学循环中扮演着重要角色。

已有报道以固体铁氧化物为电子受体时细菌的电子转移过程与以固体电极为电子受体时有相似的机理，尽管目前对这些机理的认识还不是很清楚，但这已为进一步揭示电化学活性微生物与电极间的电子转移机制有很大帮助。

目前发现的严格厌氧菌中能还原铁，且同时能以固体电极为电子受体的菌，主要分布在变形菌门中的-变形菌纲、厚壁菌门中的梭菌纲和酸杆菌门中的全噬菌纲中。

其中，硫还原地杆菌（Geobactersulfurreducens）和金属还原地杆菌（Geobactermetallireducens）是目前研究得较多的电化学活性菌种。

其所形成的电化学活性微生物膜在底物不存在时通过循环伏安测试可以观察到两对明显的氧化还原峰（相对于Ag/AgCl电极，式电位分别为#376和#295mV），在底物存在时表现出典型S形的对底物的催化特征［1，46］。

　　3．1．1变形菌门中的-变形菌纲

（1）硫还原地杆菌（Geobactersulfurreducens）属于Geobacteraceae科，地杆菌属（Geobacter），为革兰氏阴性菌，专性厌氧，电子供体较少，仅能以乙酸和氢气为电子供体，Fe?

、S、Co-EDTA、延胡索酸和苹果酸为电子受体，多分布于污泥中。

G．sulfurreducens是最早报道的厌氧条件下以电极为电子受体完全氧化电子供体的微生物。

由于