论文陈菲菲Word下载.docx

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NF-κB是一类能特异性地识别结合DNA的Rel类蛋白质二聚体转录因子[8]。

NF-κB可能作为始发炎症反应的上游环节在疾病中起重要作用。

NF-κB作为一种促进基因转录的核转录因子，参与调节、控制免疫反应及其进程的信号传导途径；

各种体内、外因素如各种微生物及病毒的代谢产物、炎性细胞因子、T细胞及B细胞的表面分子等均可使其活化[9]。

活化的NF-κB参与机体多种蛋白、酶及细胞因子的基因转录[10]、免疫与炎症反应的调节过程，如抗原递呈、T与B细胞的激活及类型转换以及免疫平衡的稳定。

NF-κB通过对白细胞介素-1β（IL-1β），IL-2，IL-6，肿瘤坏死因子（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环加氧酶-2（COX-2）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）等诱导性调节作用参与免疫细胞的增殖、分化及免疫应答。

此外，免疫细胞内NF-κB活性的改变还直接影响免疫细胞的活化、增生和凋亡。

因此NF-κB的激活就可以作为炎性反应的触发器及关键环节，诱导机体一系列炎性反应因子的产生[9]，最终导致炎性病理损伤。

CD1a是郎格汉斯细胞（Langerhanscells，LC）的标记性分子，而LC的抗原递呈功能在变应性接触性皮炎的发病过程中起重要的作用。

在变应性接触性皮炎发病过程中，每种细胞因子的作用都不是单一的，对变应性接触性皮炎的抑制或者促进作用也不是绝对的。

各种细胞因子之间可以通过合成分泌相互调节、受体表达相互调控、生物学效应相互影响，从而调节变应性接触性皮炎病理过程的进展和转归。

治疗变应性接触性皮炎的方法是在识别致病原的前提下，去除或避免再次接触致病原。

然而在实际治疗中致病原往往难以发现，或者由于变应性接触性皮炎患者有时不能圆满改善他们与变应原接触的现状，也不能随意改变工作种类，于是应用皮质激素治疗成为首选，但皮质激素的不良反应限制了其推广和应用。

白芍为芍药的干燥根，白芍总苷（totalglucosidesofpaeony，TGP）为白芍中提取的有效成分，主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类化合物。

白芍总苷的药理及临床研究发现，白芍总苷具有止痛、抗炎、保肝，以及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用，对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病有确切疗效。

现代药理研究证实，TGP可抑制大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α，IL-1β，IL-2，No，产生抗炎作用[11]。

为了了解白芍总苷在变应性接触性皮炎治疗中的作用及可能产生的作用机制，本研究通过建立小鼠变应性接触性皮炎模型，观察白芍总苷对小鼠变应性接触性皮炎大体形态变化和组织病理学改变，通过测定细胞因TNF-α的水平以及观察NF-κB、CD1a在小鼠耳组织中的表达，初步探讨白芍总甘治疗变应性接触性皮炎的可能性及作用机制。

材料和方法

1材料

1.1动物

实验用小鼠为扬州大学医学院动物中心提供的昆明小鼠42只，雌雄各半，6-8周龄，体重25-30g。

等级：

清洁剂。

小鼠饲养于金属笼中，随意饮食、饮水，周围温度20℃,湿度60%。

1.2主要试剂和试剂盒

2，4-二硝基氟苯（SigmaAldrich公司）、白芍总苷（宁波立华制药公司）、地塞米松片（浙江仙琚制药股份有限公司）、TNF-αELISA试剂盒（武汉博士德公司）、NF-κB、CD1a免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）。

1.3实验器材与仪器

皮肤圆形打孔器（直径6mm）、电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、数显游标卡尺（北京北量量具机电有限公司）、微孔板酶标仪、酶标仪洗板机。

2实验方法

2.1小鼠变应性接触性皮炎模型建立：

2.1.1DNFB配备：

250mgDNFB加入4：

1体积比的丙酮与橄榄油混合液50ml，配成0.5%的DNFB溶液致敏。

将250mgDNFB加入4：

1体积比的丙酮与橄榄油混合液125ml，配成0.2%的DNFB溶液诱发皮炎。

2.1.2取昆明小鼠10只，雌雄各半，小鼠于实验前一天在腹部备皮2cm×

1.5cm，用8%硫化钠水溶液脱毛，生理盐水充分擦洗。

实验第一天、第二天在腹部去毛部位均匀涂布0.5%的25μLDNFB溶液致敏。

实验第6天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20μLDNFB溶液诱发皮炎。

右耳涂布20μL基质[12]。

建立小鼠变应性接触性皮炎模型。

实验第7天观察小鼠左耳大体形态变化，处死后取左耳皮损行组织病理检查，判定造模是否成功。

2.2白芍总苷对小鼠变应性接触性皮炎模型的影响

2.2.1实验分组：

造模成功后，32只小鼠被随机分为4组，分别为空白组、模型组、地塞米松组和白芍总苷组，每组8只。

其中空白组未做任何处理。

2.2.2DNFB诱发模型：

小鼠于实验前一天在腹部备皮2cm×

1.5cm，用8%硫化钠水溶液脱毛，实验第一天、第二天模型组、地塞米松组和白芍总苷组小鼠在腹部去毛部位均匀涂布0.5%的25μLDNFB溶液致敏。

实验第六天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20μLDNFB溶液诱发皮炎。

右耳涂布20μL的基质[12]。

2.3给药方法白芍总苷组小鼠体重用药量为30g左右小鼠18mg/d（药物剂量按每千克体质量为《中华人民共和国药典》规定临床用量的20倍），溶于0.5%羧甲基纤维素溶液中，将药物浓度校正到实验中每30g小鼠体质量灌胃量为4ml，每次取0.4ml灌胃。

地塞米松体重用药量为30g左右小鼠0.09mg/d（按成人每天地塞米松9mg，小鼠用药量为20倍），溶于0.5%羧甲基纤维素溶液中，每次取0.4ml灌胃。

模型组每次予以生理盐水0.4ml灌胃。

实验第一天起各组自第一次涂药前2小时灌胃，连续用药五天，每天一次。

实验第六天涂药前2小时及涂药后6小时灌胃各一次。

所有小鼠于第七天采用眼球摘除法处死并取血备用。

测量小鼠双耳中部厚度，用皮肤圆形打孔器沿小鼠左耳耳缘中部打孔，所取左耳组织一分为二，置于福尔马林中备用。

一部分切片H-E染色，组织病理检查，一部分行免疫组化检查。

2.4观察指标

2.4.1耳厚度差：

数显游标卡尺测量小鼠双侧耳中部的厚度,计算诱发后左右耳厚度差。

2.4.2H-E染色及观察处死后取小鼠左耳组织常规石蜡切片，H-E染色。

用光镜观察H-E染色切片中有无病理变化和各组织间有无差异，并观察染色切片中细胞类型的变化及差异。

2.4.3NF-κBp65在皮损处的表达：

小鼠左耳组织进行常规石蜡包埋，连续切片。

采用免疫组化的方法检测小鼠左耳皮损处NF-κBp65的表达：

2.4.3.1液体配置：

95%乙醇（95ml纯乙醇加5ml蒸馏水）、85%乙醇（85ml纯乙醇加15ml蒸馏水）、75%乙醇（75ml纯乙醇加25ml蒸馏水）、PBS配方：

Nacl8.0g，Kcl0.2g。

12H2ONa2PO43.63g，KH2PO40.24g加1000ml蒸馏水、免疫组化专用PBS（PH7.2-7.6）：

1000ml蒸馏水中加Nacl8.5g，Na2HPO42.8g，NaH2PO40.4g（如果用的复合水的磷酸盐，应加上分子式中水的含量）、0.01M枸橼酸盐缓冲液:

PH=6.0左右，1000ml蒸馏水，枸橼酸三Na（C6H5Na3O7·

2H2O）3g，枸橼酸（C6H8O7·

H2O）0.4g、显色液：

在试管中先加1ml1×

HRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A50ul，试剂B50ul，试剂C50ul混匀。

2.4.3.2步骤：

60℃烤箱烘片（小鼠左耳组织石蜡切片）35min，脱蜡二甲苯3次，每次15min。

梯度乙醇：

100%乙醇2×

5-8min，95%乙醇2×

5-8min，85%乙醇1×

5-8min，75%乙醇1×

5-8min，3%H2O2室温10-15min，蒸馏水3×

5-8min。

抗原修复：

将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0），加热（微波炉）至沸腾后盖紧高压锅至气体喷出后1-2min，切断电源，冷却后，打开锅盖取出标本。

PBS冲洗2min×

3次。

5-10%BSA封闭液封闭，每个标本加入约100ul，37℃×

30min，甩去封闭液不洗，将切片分为两组，一组均加一抗，一组为阴性对照，不加一抗（一抗1：

100用PBS稀释）。

4℃过夜。

PBS洗3×

2min。

两组切片均加二抗（山羊抗小鼠IgG约100ul）,37℃20min，PBS洗3×

2min，滴加试剂SABC37℃20min，PBS洗4×

5min，DAB显色，反应10-20S，蒸馏水洗涤。

将切片置于苏木精染色1min，取出用40-50℃温水洗涤，95%乙醇5-8min，100%乙醇5-8min，二甲苯5-8min脱水，透明，待充分干燥，树胶封片后有棕黄色颗粒着染的细胞为阳性细胞。

观察NF-κBp65的表达。

2.4.4观察CD1a在小鼠左耳皮损处组织的表达：

方法同NF-κBp65。

2.4.5血清TNF-α检测小鼠处死时采用眼球摘除法取血约1.5ml，静置15min后，3000r离心15min，分离血清，置于-20℃冰箱中待检，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中细胞因子TNF-α水平。

2.4.5.1ELISA试剂盒组成:

酶标板（CoatedWells）96孔,酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml,10×

标本稀释液（SampleBuffer）12ml,20×

浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml,第一抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml

终止液（StopSolution）12ml。

2.4.5.2检测步骤：

收集血清，-20℃保存。

标准品液配置：

使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。

设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。

在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。

如此反复做对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。

第八管为空白对照。

10×

标本稀释液用蒸馏水做1：

10倍稀释。

洗涤液；

用重蒸水1：

20稀释。

加样：

每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120min。

洗板：

用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，