种新的菊花NAC的表达转录因子基因提高烟草的耐盐能力Word格式文档下载.docx
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引言高盐是主要的环境胁迫抑制植物的生长发育和限制的地理分布和利用植物。
植物对盐胁迫生存，通过一系列的反应分子，生理，和细胞过程的高潮在盐胁迫的耐受性。
在这些反应和适应，许多盐诱导基因诱导（Bartels和桑卡2005
chinnusamy；
等人。
2004；
骑士和骑士2001，筱崎和山口筱崎2007）。
其中，转录因素（TFS）作为主开关调节应激反应的基因和功能在建立压力公差（中岛等人。
2009；
Vinocur和奥特曼2005；
朱2002）。
在这些转录因子一些成员，NAC，AP2/EREBP，bZIP蛋白，MYB，WRKY，MYC，Cys2/His2-type锌指蛋白家族起关键作用的调节防御生物和环境响应应力（Agarwal等人。
2006chinnusamy等。
2006；
10等人。
2006）。
含蛋白质的NAC结构域，其中含有一个高度保守的N-末端的DNA结合NAC结构域和一个可变的转录调控的C-末端结构域，构成的一个最大的植物特有的转录因子家族。
他们参与的过程，如生物和非生物的宽范围应激反应，植物发育，衰老（AIDA等人。
1997；
杜瓦尔等人。
2002；
奥尔森等人。
大冈等人2005。
2003；
郑等人。
2009）。
一个号码胁迫响应的NAC结构域含有蛋白质已在各种植物物种鉴定。
几个研究表明，某些NAC的表达许多胁迫相关基因改变的表达基因在转基因植物和增强的耐受性盐，冷，和/或脱水应力（Hu等人。
2006，2008；
中岛等人。
大西等人2007。
2005；
Tran等人。
2004）。
然而，N-乙半胱氨酸的作用在植物胁迫响应基因还不为人们所知道。
菊花是最有名的一个在世界园林观赏树种。
然而，高的土壤盐度对菊花生长严重威胁在切花菊生产。
为了提高耐盐性的菊花，和一个新的功能的分离鉴定盐胁迫响应的NACTF基因，DgNAC1菊这里报道。
此外，盐胁迫，DgNAC1是由ABA，干旱诱导，冷处理。
35S：
DgNAC1烟草改进的耐盐胁迫的连续应力分析。
材料与方法
植物材料和胁迫处理
（独本菊grandiform）简历。
劲霸育苗温室暴露空气对脱水滤纸，或进行4C冷应激。
盐和ABA处理，幼苗被放置在250毫米的NaCl和0.1毫米ABA，分别为（Tong等人。
所有切除叶样品处理和对照植株采取长达24小时的治疗，立即冻结液态氮，并存储在80
C
RNA提取。
DgNAC1基因的分离
对于一个30-race，设计引物GSP1（50-itggataatgcaigagtaicgit-30）相应要转换的氨基酸wimheyr地区。
50种族的引物GSP2，50-gtattgat：
agtggcggatgtgacga-30，和gsp3，50-cat
atgtgttgattgtacatccgag-30。
比赛反应是根据制造商的执行协议（Invitrogen种族cDNA扩增
试剂盒）。
全长cDNA序列的单结合50-race片段和30-race片段得到的。
最后，一对引物（F1，50-tccaaagagcgcagactagccactgagc-30，和F2，50-aatagtcaataagcccacttgctta-30）然后从假定50和设计30非翻译区（UTR）的全长cDNA序列。
所得的DNA片段和种族
经琼脂糖凝胶电泳，克隆到了产品（祝）与pMD18-T载体测序（Invitrogen公司，北京）。
RNA分离和半定量RT-PCR测定法
菊花组织总RNA是不同的用Trizol提取。
第一链cDNA是1总RNA和LG
1将上标的合成
酶Ⅱ（Invitrogen公司，美国）根据制造商的协议。
作为对照，18S
rRNA基因从各种组织中扩增出菊花。
用于检测DgNAC1基因表达引物有了50-gcagataagccaattggaaagccga-30，反向50-atggagagagttgaaagtcattgta-30。
PCR法如下：
预变性94
5分钟，然后34周期为30秒94
C，30S在59
C，50秒72
DgNAC1，31周期为18SrRNA和在72
C.扩增8分钟最终扩展产品在1.2%琼脂糖凝胶解决琼脂糖凝胶电泳检测。
从烟草叶中提取的总RNA与合成的第一链的cDNA和上面的相同。
所有的RT-PCR实验至少重复三倍。
亚细胞定位
DgNAC1的
ORF克隆到SacI和EcoRI位点的psat6-gfp-n1向量。
这向量包含了一个修改后的GFP在红移NcoI位点EcoRI。
的DgNAC1
GFP构建通过粒子转化洋葱表皮细胞轰击前面描述的（王和方2002）。
GFP瞬时表达通过使用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白显微镜。
在烟草中过表达的DgNAC1
过表达在烟草（Nicotiana
DgNAC1烟草品种。
克桑西）的cDNA克隆，DgNAC1在pBI121（clotech）取代格斯基因。
的DgNAC1基因驱动下花椰菜花叶病病毒（CaMV）35S启动子的引入烟草植物通过根癌农杆菌介导的研究
变换（一等。
1988）。
转基因烟草植物的耐盐性分析
线oe-3
T2代植株，oe-12和oe-20用于随后的实验。
盐治疗：
约100的种子和野生型DgNAC1
OX转基因T2线电镀150mMNaCl培养基板。
这个盘子放置在一个16小时的光/8小时在生长室暗周期在25
C.得分后发芽率6天。
测定了发芽所描述的熊等人。
（2001）。
盐处理的野生型和II：
DgNAC1
OX转基因T2线发芽MS培养基为14天，在这之后，幼苗
被转移到充满在1:
1的比例soilvermiculite塑料盆。
幼苗重量和T2代转基因烟草植株被放置在一个增长室16小时的光/暗周期下8小时，在25
C.盐处理方法如下。
23天之后植物浇水用400毫米的NaCl7天，在这之后，照片拍摄的（萨阿德等人。
2010）。
然后，烟草植物进行了重新浇灌定期为恢复过程。
生存率得分后6天。
在耐盐试验进行了三次，标准误差（±
SE）进行测定，比较。
结果
菊花中DgNAC1基因的分离
基于拟南芥ATAF1保守区，水稻OsNAC6，和大豆gmnac2，退化引物进行30-race提出了以菊花得到678bp的片段。
全长cDNA的获得50-race，并指定DgNAC1（GenBank
登录号hq317452）。
序列分析表明，DgNAC1
cDNA为1137bp的长度，包括一个855bp的完整的开放阅读框侧翼与50-utr
117bp和30-utr的165bp的（图1）。
预测蛋白质的DgNAC1由284个氨基酸与计算32.9kDa的分子质量及其理论等电点为7.13。
预测的氨基酸序列的DgNAC1相比其他NAC结构域含有蛋白质从水稻，大豆，拟南芥，甘蓝型油菜用DNAMAN（6版）（图2）。
结果表明DgNAC1包含一个高度保守的NAC
DNA结合域，其中包括五共识：
5–子域（25，34–B：
51，C：
60–96，D：
103–130，E：
144–158）中的N-末端区域和一个高度可变的C-末端的转录调节域。
保守的NAC结构域进行检索的neighborjoining建设大型4.1系统（图3）。
系统发育分析表明，大部分46分离的蛋白质属于十一个不同的子群的ATAF1，ataf2，atnac3，osnac3，午睡，越南，ANAC042/JUB1，越南盾，南昌，尖，和燕鸥。
DgNAC1DgNAC1是聚成ATAF1子群，和更多为OsNAC6密切相关。
图1核苷酸推导的氨基酸序列的DgNAC1（GenBank登录号hq317452）。
NAC域是下划线
DgNAC1的表达分析
在不同的DgNAC1空间特异性表达在成人阶段组织RT-PCR。
结果表明，DgNAC1表达更
丰富的根和花比茎叶（图4A）。
探讨DgNAC1的表达模式基因在胁迫如干旱，高盐，低温度和暴露于ABA，与分析RT-PCR法，分别。
表达的保持在低水平的DgNAC1影响正常条件（图4B）。
ABA处理，表达水平的迅速增加，达到DgNAC1在5小时的最大并保持稳定的高24小时的水平（图4c）。
的浓度DgNAC1
mRNA的迅速增加和内达到高峰5小时的NaCl处理（图4D）。
表达的DgNAC1缓慢增加，在12小时内达到高峰，在低温处理（图4E）。
表达的的DgNAC1明显增加，1h后脱水和24小时保持稳定的高水平（图4）。
RT-PCR分析表明，表达该基因可引起的干旱，盐，低温和ABA。
在细胞核中的DgNAC1定位检查DgNAC1亚细胞定位介绍了蛋白质，DgNAC1
GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞通过粒子轰击。
如图5所示，激光共聚焦显微镜检查结果表明GFP融合蛋白是针对DgNAC1进入细胞核，而控制GFP仅分布于整个细胞质。
这些结果表明，DgNAC1蛋白是一个核定位蛋白。
图2。
比较推导的氨基酸序列的DgNAC1和其他的NAC结构域蛋白。
比较通过DNAMAN
（6版）。
氨基酸保守的残基在所有七序列阴影黑色，和那些六的保守序列被围困在浅灰色。
五个子域（一–E）下划线。
水稻（OsNAC6，bab89800）；
拟南芥拟南芥（ATAF1，x74755.1
ataf2，x74756.1）；
甘蓝型油菜（bnnac5-1，aap35050；
bnnac5-11，aap35053）；
大豆（gmnac2，aay46122）。
DgNAC1的过表达赋予转基因烟草抗盐
在烟草中过表达DgNAC1CaMV35S启动子的控制产生探讨DgNAC1盐应力作用植物。
34行中的五个独立转化子，转基因株系（oe-3，oe-7，oe-12，oe-14，并用RT-PCR证实oe-20）
分析（图6a）。
DgNAC1转基因烟草显示没有可检测的表型缺陷（如根的深度和体积，与株高和花）（数据未显示）在正常条件下。
对转基因植株的种子萌发率（oe-3，oe-12，和oe-22）和重量在150毫米7天的NaCl培养基平板得分。
作为图6b显示，转基因种子表现出更高的发芽率（70–86%）比野生型种子（26%）。
当幼苗浇灌400毫米的NaCl溶液中7天，对照组的枯萎和黄化比转基因株系
图3的DgNAC1和其他植物的系统进化树分析NAC结构域蛋白。
该树的构建邻接法withmegaprogram（版本4.1）。
分公司数字表示在1000的bootstrap值的百分比抽样复制和规模反映了分支长度。
的加入号码如下：
AhNAC1（ACD39411）,GmNAC2（AAY46122）,SlNAM1（GU256056）,ATAF1（X74755.1）,BnNac5-11（AAP35053）,BnNac18（AAP35054）,OsNAC6（BAB89800）,
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