全胃切除术后家兔营养不良的实验研究Word下载.docx

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胃切除后家兔小肠近段GLUT5mRNA表达明显下降，SGLT1mRNA表达无变化。

迷走神经干的切断在这些病理生理变化中不起重要作用。

【关键词】全胃切除术；

迷走神经干切断术；

营养不良；

家兔

【Abstract】ObjectiveToexplorepreliminarilythecausesforanorexia,weightreductionandmalnutritionaftertotalgastrectomybyestablishingrabbitmodeloftotalgastrectomyandvagotomy.MethodsTwentyfourNewZealandrabbitsweredividedrandomlyintogroupA（controlgroup）,groupB（undergonetotalgastrectomy）andgroupC（undergonevagotomy）.Theratiooftheweight,theamountoffoodtaken,thecontentofcholecystokinin（CCK）andmotlininplasma,theexpressionofthemRNAofGLUT5andSGLT1attheepitheliumoftheproximalpartofsmallintestineingroupsBandCafteroperationwereobservedandcomparedwiththoseingroupA.ResultsComparedwithgroupA,theratiooftheweightandtheamountoffoodtakeningroupBwerereducedmoredistinctly.ThecontentofmotliningroupBshowedlittlechange,whilethecontentofCCKwaselevatedatdays3and14afteroperations（）.TheexpressionofGLUT5mRNAatduodenumandjejunumdecreasednotablyingroupBcomparedwithgroupA（and　respectively）.ButtheexpressionofGLUT5mRNAatduodenumandjejunumshowednostatisticaldeferenceingroupBcomparedwithgroupA（）.IngroupC,alltheseindiceshadnostatisticaldeferencecomparedwithgroupA（）.ConclusionsAftertotalgastrectomy,theperistalsisofsmallintestineandtheevacuationofthefoodininterdigestiveperiodcorrelatedwithmotlinmaynotchange,whiletheincreaseofthecontentofCCKmaycausecentralfeedinginhibitionandanorexia.Aftertotalgastrectomy,theexpressionofGLUT5mRNAattheproximalpartofsmallintestineoftherabbitsisdecreasedbutthatofSGLT1mRNAremainsunchanged.Vagotomyshowsnocontributiontoallthesepathophysiologicchanges.

【Keywords】Totalgastrectomy;

Vagotomy;

Malnutrition;

Rabbits

全胃切除术是治疗胃癌的重要术式之一。

但由于其手术范围广，创伤较大，术后不可避免地会发生一些病理生理上的改变。

全胃切除同时也伴随着迷走神经干的切断，手术以后所出现的种种病理生理方面的改变是由于机体失去胃引起的还是迷走神经干切断引起的，也没有明确答案。

本实验通过家兔全胃切除和迷走神经干切断模型的建立，观察术后体质量、血浆胆囊收缩素、胃动素含量、近段小肠上皮单糖转运体：

Na+依赖性单糖转运体1（sodiumdependentglucosetransporter1，SGLT1）和易化性单糖转运体5（facilitatedglucosetransporter5，GLUT5）的mRNA表达情况等指标的变化，初步探讨全胃切除术后营养状况低下的原因。

1材料与方法

　材料

　动物：

成年新西兰兔24只，雌雄不限，体质量～kg，由复旦大学附属中山医院动物实验室代购。

　仪器：

立式压力蒸汽灭菌器（LSB50L型）购自上海华线医用核子仪器有限公司；

低温高速离心机（Labofuge400R型）购自德国HeraeusInstruments公司；

电热恒温水浴锅（型）购自上海医疗器械五厂；

RNA/DNACalculator仪（GeneQuantⅡ型）购自PharmaciaBiotech公司；

PCR仪（PTC150型）购自美国MJResearch，INC.公司；

电泳仪购自（DYA型）上海生化所巴斯生物技术开发公司；

测量用电泳条带灰度软件（AlphaImagerTM2000Documentation&

AnalysisSystem，Alphamager软件）购自AlphaInnotechCorporation公司。

　试剂：

SK1361试剂盒、DEPC液、Oligo（dT）15、10mmol/L4dNTP混合液、RevertAidTMMMuLV反转录酶、正义及反义引物、TaqPCR催化酶、GeneRulerTM50bpDNALadder、琼脂糖凝胶，均购自生工生物工程（上海）有限公司。

溴化乙锭由复旦大学附属中山医院中心实验室惠赠。

　动物模型的建立

家兔分为3组，每组8只。

A组为假手术组（对照组），B组为全胃切除组，C组为迷走神经干切断组。

氯胺酮1mg/kg肌肉注射麻醉。

A组家兔打开腹腔后用生理盐水纱布覆盖内脏，1h后关闭腹腔。

B组家兔行全胃切除（切除范围从贲门至幽门近侧约cm处），然后将食管拉下与近段十二指肠行端侧吻合。

C组家兔进腹后钝性分离食管下段周围结缔组织，包括筋膜，神经，血管，予切断，结扎。

使食管下段贲门周围完全游离，食管肌层光滑，不见任何结缔组织、神经组织。

手术后均肌肉注射庆大霉素针4万U。

3组家兔术前均禁食12h（不禁水），B组家兔术后第1、2天静脉输液。

A、C组术后不必输液。

3组家兔均于术后第2天饮5%葡萄糖生理盐水，第3～5天喂食青菜叶，第6天过渡到正常兔饲料饮食。

　体质量的测定及体质量比的定义

3组家兔分别于手术日（术前）﹑术后第5、10、15、20、25、30天上午8点喂食前测量体质量。

B组家兔手术后即刻测量切下的胃质量，术后测得体质量加上胃质量即为当日体质量数据。

因3组家兔术前可能存在着体质量上的不均衡（为提高手术存活率，B组家兔一般采用较健壮，体质量偏重的家兔），故采用体质量比作为计算指标，即每只家兔体质量以手术日（术前）为基准，计算当日体质量测量数值与手术日（术前）体质量测量数值的比值，定义为体质量比。

　进食量的测定

3组家兔分别于术后第10、15、20、25、30天测定24h的进食量（计算当天上午8时至第2天上午8时的进食量）。

　血浆胃动素﹑胆囊收缩素含量的测定

3组家兔分别于术后第1、3、7、14天上午8点从耳缘动脉采血～4ml。

采血前禁食（不禁水）12h。

然后制成血浆。

用放免法测定血浆胃动素和胆囊收缩素的含量（由第二军医大学神经生物学教研室代测）。

　近段小肠上皮GLUT5和SGLT1mRNA的检测

　黏膜标本的采集：

3组家兔小肠黏膜标本均在术后第30天采集。

采集时间为16：

00-17：

00。

采集前禁食24h（不禁水）。

家兔麻醉后切开腹腔，分别距离幽门10cm和100cm向远侧取下约10cm的肠段，作为十二指肠段和空肠段。

将取下的肠段沿对系膜缘纵向剪开，放入无菌冰生理盐水震荡漂洗3次，最大限度的清洗掉黏附在黏膜上皮的小肠内容物，包括食物残渣、黏液、杂质。

用经过消毒、1∶1000DEPC液脱酶后的玻璃片将黏膜组织刮下。

RTPCR方法检测小肠黏膜SGLT1和GLUT5mRNA的表达。

PCR过程中所有离心管﹑移液管都要经过灭菌。

　PCR扩增步骤：

94℃变性5min，然后进行30个循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min。

扩增结束后PCR产物在%琼脂糖凝胶（加入溴化乙锭5μl/100ml）中电泳。

所获条带用灰度测量软件进行灰度分析，测定目的基因产物灰度和内参照（βactin）基因产物灰度的比率（PCR率），半定量测定目的基因的表达。

见表1。

　统计学分析

3组数据均数差别检验采用t检验。

表示差异有统计学意义。

　　2结果

　术后3组家兔体质量变化、进食量变化、血浆胃动素和胆囊收缩素的值（表2～5）表1引物序列及其在基因组中的位置

核酸序列位置产物大小SGLT1：

Sence5′TCATGATGGTGGGCTCTGTG3′652～671Antisence5′GCACGACGCAGGCAACTTTG3′1065～1046414bpGLUT5：

Sence5’TGACGGAGTTCTACAACGAC3′161～180Antisence5′CAAGTACATAGGGACCACGT3′474～455313bpβactin：

Sence5′CCTGTACGCCTCTGGCCGTACCACT3′2088～2112Antisence5′CTGTAGCCGCGCTCGGTGAGGATCT3′2261～2237174bp表23组家兔体质量比变化表33组家兔术后进食量对比表43组家兔血浆胃动素含量对比（