实验1 普通光学显微镜的构造与使用Word文档格式.docx

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3镜臂连接镜筒和镜座。

有的镜臂是固定的有的可向后方倾斜其作用是支撑镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。

4物镜转换器转换器上可安装35个物镜一般是3个物镜低倍镜、高倍镜、油镜。

转动转换器时可以按需要调换各种物镜将之推到使用位置上。

图1-1光学显微镜构造示意图5载物台载物台呈长方形中央有一孔为光线通路。

在台上装有弹簧标本夹和推进器。

6推进器推进器由一横一纵两个推进齿轴和齿条构成转动其上螺旋可使标本片向前、后、左、右移动。

研究型显微镜的纵横架杆上刻有刻度标尺构成精密的平面坐标系。

如需要重复观察已检查标本的某一物像时可在第一次检查时记下纵横标尺的数值下次按数值移动推进器就可以找到原来标本的位置。

1.物镜转换器2.物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.虹彩光圈7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋7粗调螺旋粗调螺旋用于粗放调节物镜和标本的距离。

老式单目镜显微镜的粗调螺旋向前扭动镜头下降接近标本。

新式双目镜显微镜如Motic显微镜镜检时双手向后扭动使载物台上升让标本接近物镜反之则下降标本远离物镜。

使用显微镜观查标本时主要使用粗调螺旋调节。

8微调螺旋用粗调螺旋只能粗放地调节焦距难于观察到清晰的物像因而需要用微调螺旋做进一步调节。

其每转一周镜筒移动0.1mm。

新式研究型显微镜粗、微螺旋为共轴式。

原则上微调螺旋每次旋转不超过一周。

9光圈在聚光器下方可任意开闭用来调节射入聚光器光线强弱。

10接目镜目镜作用是将物镜放大了的实像进行第二次放大形成虚像并映入眼帘。

不同的目镜上刻有5×

、10×

、15×

等字样以表示该目镜的放大倍数。

普通光学显微镜常用的目镜主要是惠更斯目镜。

研究型显微镜配有性能更好的目镜如补偿目镜K、平场目镜P和广视场目镜WF等。

照相时选用照相目镜NFK。

11接物镜物镜安装于转换器上入射光线通过物镜时使被检物像形成第一次放大的实像。

普通显微镜装有低倍镜10×

、高倍镜40×

和油镜100×

三种消色差物镜外壳上标有“Ach”字样通常与惠更斯目镜配合便用。

使用低倍镜和高倍镜时物镜与标本间的介质是空气称之为干燥系物镜。

而使用油镜时物镜与标本间的介质是香柏油称之为油浸系物镜。

油镜标有HI或Oil字样及镜头下缘刻有白环或红环。

检查细菌标本要用油镜。

研究型显微镜配有性能更好的物镜如复消色差物镜Apo、平场物镜Plan、平场消色差物镜PlanAch、平场复消色差物镜PlanApo等。

12聚光器由聚光透镜、升降螺旋和能调节开孔大小的虹彩光圈组成装在载物台下面可通过升降螺旋而起落。

其作用是将光线聚光于标本之上增强照明度。

普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器分为阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器三种。

研究型显微镜如MoticBA400显微镜配有性能更好的消色差摇出式聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜4×

大视场照明的需要。

齐明聚光器虽质量最好但不适于4倍以下的物镜。

13反光镜早期普通光学显微镜常用自然光检视标本在镜座上装有反光镜由平凹两面镜子组成。

光线较强时用平面镜光弱时用凹面镜可自由旋转方向以将最佳光线反射入聚光器。

新式研究型显微镜镜座上装有光源并由电流调节螺旋来调节光照强度。

2.2油镜使用的工作原理在显微镜的光学系统中物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。

与其他物镜相比油镜的放大倍数最大使用也比较特殊需在载玻片与镜头之间滴加香柏油这主要有如下二方面的原因1增加照明亮度油镜的放大倍数虽然可达100×

但因焦距很短镜头直径很小进入镜头中的光线亦较少故所需要的光照强度最大图1-2。

当油镜头和标本玻片之间的介质为空气时因空气折射率n1.00与玻璃的折射率n1.55不同会有一部分光线被折射而不能进入镜头内使视野更暗物像显现不清。

若在镜头与标本玻片之间滴上与玻璃的折射率相仿的油类如香柏油n1.52等则光线不发生折射从而增加了视野的照明亮度图1-3。

图1-2物镜的焦距、工作距离和虹彩光圈的关系图1-3干燥系物镜A与油浸系物镜B的光线通路2增加显微镜的分辨力显微镜的分辨力或分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。

它与物镜的数值口径成正比与光波长度成反比。

因此当光波波长一定时物镜的数值口径愈大则显微镜的分辩力愈大被检物体的细微结构也愈清晰地区别出来。

分辨力可由下列公式表示分辨力最大可分辨距离λ/2NA式中λ为光波波长0.40.7�0�8mNA为物镜的数值口径值。

它是光线投射到物镜上的最大角度称为镜口角的一半正弦与介质的折射率之乘积即NAn·

sinα。

式中α为光线最大入射角的半数它取决于物镜的直径和焦距。

在实际应用中光线入射角最大只能达到120�0�2其半数的正弦为Sin60�0�20.87。

以空气为介质时NA1×

0.870.87而以香柏油为介质时NA1.52×

0.871.32故以香柏油为介质的油镜要比用空气为介质的高倍镜分辩力高因而细菌用油镜才可观察到。

然而显微镜的放大倍数越高并不等于其分辨力越高。

假如采用放大率为40×

的高倍镜NA0.65和放大率为24×

的目镜虽然总放大率为960×

但其分辩力只有0.42�0�8m若采用放大率为90×

的油镜NA1.25和放大率为9×

的目镜虽然总放大率为810×

但却能分辨出0.22�0�8m之间的距离因而显微镜的总放大倍数越高并不是其分辨力越高。

3实验材料3.1菌种细菌三型、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、大肠杆菌Escherichiacoli等染色玻片标本。

3.2溶液或试剂香柏油、二甲苯。

3.3仪器与其他用具显微镜、擦镜纸等。

4普通光学显微镜的使用流程安置→调光源→调目镜→调聚光器→镜检低倍镜→高倍镜→油镜→擦物镜头→复原5操作步骤5.1观察前的准备5.1.1显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上镜座距实验台边缘约10cm。

镜检时姿势要端正。

一般用左眼观察右眼绘图或记录两眼同时睁开以减少眼睛疲劳。

5.1.2光源调节安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。

反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时较强的自然光源用平面镜较弱的照明光源用凹面镜并调节其角度使视野内的亮度适宜、均匀。

凡检查染色标本时光线应强检查未染色标本时光线不宜太强可通过光圈、聚光器、反光镜调节适宜的光线。

5.1.3双筒显微镜的目镜调节根据使用者的个人情况双筒显微镜的目镜间距可以适当调节而左目镜上一般还配有屈光度调节环可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

5.1.4聚光器数值孔径值的调节正确使用聚光镜才能提高镜检效果。

聚光镜的主要参数是数值孔径它有一定的可变范围一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度可以得到各种不同的数值孔径以适应不同物镜的需要。

5.2显微镜观察一般情况下特别是初学者进行显微镜观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。

因为低倍数物镜视野相对较大易发现目标和确定检查的位置。

5.2.1低倍镜观察将标本片置于载物台上用弹簧夹固定移动推进器使观察对象处于物镜正下方。

旋动粗调螺旋使物镜与标本片距离约lcm单镜筒显微镜或0.5cm双镜筒显微镜再以粗螺旋调节使镜头缓慢升起单镜筒或使载物台缓慢下降双镜筒直到物像出现后再用微螺旋调节使物像清晰。

然后移动标本玻片将观察目标移至视野中心后仔细观察与绘图。

5.2.2高倍镜观察由低倍镜直接转换成高倍镜至正下方。

转换时需用眼睛于侧面观察避免镜头与玻片相撞。

调节聚光器和光圈使视野亮度适宜而后微调细螺旋使物像清晰。

利用推进器移动标本找到需要观察的部位并移至视野中心仔细观察或准备用油镜观察。

5.2.3油镜观察先将光圈开至最大集光器升至最高位调节好光源使照明亮度最强。

在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后用粗调节螺旋将镜筒远离载物台然后在标本上滴加香柏油切勿过多否则视野模糊转换油镜头从侧面注视小心将之浸入油滴中使其几乎与标本片相接触为度注意切不可将油镜镜头压到标本否则不仅压碎玻片还会损坏镜头。

用粗螺旋缓慢升起镜筒单镜筒或下降载物台双镜筒至物像出现后再以细螺旋调至物像清晰。

如果油镜已离开油面而仍未见物像可再将镜头浸入油中重复以上操作至物像清晰为止。

5.3显微镜用后的处理观察完毕台起镜头立即用擦镜纸擦去镜头上的油再用擦镜纸蘸取少许二甲苯香柏油溶于二甲苯或乙醚乙醇混合液擦去镜头上的残留油迹最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。

严禁用手或其他纸擦镜头以免损坏镜头。

用绸布清洁显微镜的金属部件。

将各部分还原将物镜转成“八”字形再将载物台下降至最低降下聚光器以免与物镜相撞反光镜垂直于镜座。

套上镜套放回柜内或镜箱中。

6实验结果与报告1分别绘出用油镜观察到的细菌的形态图。

注意观察它们的个体形态、大小、排列方式。

有芽孢的细菌观察其菌体两端情况及芽孢着生位置。

7思考题1观察细菌时为何使用油镜它与干燥系物镜使用方法有何不同使用时注意哪些问题2普通光学显微镜的目镜与物镜的常用放大倍数有几种显微镜的放大倍数越高分辩力越高吗为什么举例说明。

3试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。

为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节螺旋的误操作4根据实验体会谈谈应如何根据所观察微生物的大小选择不同的物镜进行有效的观察。

实验2细菌的革兰氏染色及其形态观察1目的要求1了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

2学习掌握革兰氏染色技术进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。

2基本原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

根据细菌细胞壁的结构和化学组成的不同经革兰氏染色后呈现不同的染色反应可将所有细菌区分为两大类即革兰氏阳性菌用G表示和革兰氏阴性菌用G-表示。

当细菌用结晶紫初染后像简单染色法一样所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物从而增强了染料与细菌的结合力。

染色关键在于脱色剂的脱色作用。

当用乙醇或丙酮处理时两类细菌的脱色效果是不同的。

G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成壁厚、类脂质含量较低用乙醇或丙酮脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小透性降低从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

G-细菌则不同由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较高所以当脱色处理时类脂质被乙醇或丙酮溶解细胞壁通透性增大使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来用复染剂复染后细胞被染上复染剂的红色。

3实验材料3.1菌种大肠杆菌Escherichiacoli约24h营养琼脂斜面培养物枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis或蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus约1820h营养琼脂斜面培养物。

3.2染色剂草酸铵结晶紫染色液、鲁格尔氏碘液、95乙醇、0.5番红沙黄染色液。

3.3仪器与其他用具显微镜、酒精灯、载玻片、接