无菌检验标准操作规程作业指导书Word格式.docx

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（1）在检验前一天取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种一环至需氧一厌氧培养基内，在30～35℃培养16～18h后，用0．9％无菌氯化钠溶液稀释至10～100cfu／ml（可通过比浊法或稀释后用1m1接种平板来确认）。

（2）取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物一接种环种于相同培养基内，于30～35℃培养18～24h后，用0.85％无菌氯化钠溶液稀释至10～100cfu／ml。

（3）取白念珠菌[CMCC（F）98001]真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物一接种环种于相同培养基内，于20～25℃培养24h后，用0．85％无菌氯化钠溶液稀释至10～100cfu／ml。

三、样本制备

根据检样的类型与大小，以及带孔（腔）与否，可以按照以下不同的方法进行制备。

1．敷料类等非管道类样品：

取2个包装内的样本，剪成约10mm×

30mm大小的样片21片，接种需氧一厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管。

每培养管含培养基40m1，各接种3片样片。

2．注射针、针灸针、缝合针、棉签等小样本：

可直接接种需氧一厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管。

每管含培养基15ml。

3．对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品可用浸有洗脱液的无菌棉拭子涂抹采样，被采表面<

100cm。

时采样全部表面，被采表面≥100cm。

时采样面积为100cm。

4．输液（血）器等导管类样本：

选7支样本，以无菌注射器吸取5.O～10.Oml无菌洗脱液注入管内往返摇荡5次。

将样本洗脱液分别接种需氧一厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管。

培养管含培养基15ml，每管接种样本洗脱液1.0ml。

5．注射器样本：

选7支样本，吸取洗脱液2.O～10.0ml，将芯杆抽取至全程刻度，振摇5次。

将各管洗脱液分别接种需氧一厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管。

其中洗脱液接种量分别为：

1ml注射器0.5ml；

2ml注射器1.0m1；

5～10m1注射器2.0ml；

20～50ml注射器5.0m1。

培养基含量按以下标准选择：

洗脱液接种量在2m1以下者，每管为15ml；

接种量在5ml者，每管为40ml。

6．其他样本：

不能用上述方法处理的，可用浸有洗脱液的无菌棉拭子涂抹法采样。

每个样本涂采面积不得少于25c㎡。

采样后将棉签直接剪人培养管中。

每次检测7个样本，分别接种需氧一厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管，每支培养管含培养基15m1。

四、样本培养

在不同样本制备过程中，都必须在其中一支加有样本的需氧一厌氧菌培养管中接种预先准备的1：

1000稀释的金黄色葡萄球菌1ml，以作为阳性对照管。

将含有检样的需氧一厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于30～35℃培养5日；

含有检样的真菌培养管与阴性对照管于20～25℃培养7日。

培养期间逐日检查是否有菌生长，如加入检样的培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取培养液转种人另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72h后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片染色，用显微镜观察是否有菌生长。

五、结果判定

阳性对照在24h内应有菌生长，阴性对照在培养期间应无菌生长，如需氧一厌氧菌及真菌培养管内均为澄清或虽显浑浊但经证明无菌生长（接种管内液体到相应的培养皿，以证实是否有菌生长，培养时间不得少于48h），判为灭菌合格；

如在7支需一厌氧菌及真菌培养管中，任何1支显示出浑浊现象，并证实有菌生长，应重新取样，分别用同样方法复试2次。

除阳性对照外，其他各管均不得有菌生长，否则判为灭菌不合格。

无菌试验结果为合格，应报告：

未检出需氧一厌氧菌及真菌；

不合格报告，则报告为：

检出需氧一厌氧菌或（及）真菌。

六、注意事项

1．提倡“四手操作”，严格遵守无菌操作。

凡有塑料、纸塑、纸袋等包装的物品，打开前应采用75％乙醇棉球在开口处擦拭3遍（每一次更换1个乙醇棉球）。

操作中所使用的血管钳、镊子等应先浸蘸乙醇溶液，再过酒精灯消毒，反复消毒3次后方可使用；

当操作不同物品时应重复上述消毒方法。

2．实验前操作者应严格手卫生，必要时应佩戴无菌乳胶手套。

操作者应穿戴灭菌帽子、口罩与隔离衣。

在整个操作过程中，操作者的肢体动作幅度不应过大；

被检物品一旦与污染物品表面接触，应立即终止操作，该件样本制备作废，重选另一件未被污染的物品进行采样。

3．在实施样本制备前，应先取需氧一厌氧菌及真菌培养管各1支，打开培养管的盖子（塞子），置高效过滤器下方的台面，直接暴露于空气中直至实验结束，旋上盖子（塞回塞子）后，作为阴性对照与样本一起培养。

4．若灭菌因子为化学灭菌剂，采样液中应加入相应的中和剂。

[附]无菌检验用试剂与培养基配方

1．无菌检验用洗脱液：

吐温--801g

蛋白胨10g

氯化钠8.5g

蒸馏水1000ml

将各成分加入到1000ml0.03mol／LPBS液中，加热溶解后用NaOH或盐酸调pH至7．2～7．4，于121℃压力蒸汽灭菌20min备用。

2．需氧一厌氧菌琼脂培养基：

酪胨（胰酶水解）15g

牛肉膏3g

葡萄糖5g

氯化钠2．5g

L一胱氨酸0．5g

硫乙醇酸钠0．5g

酵母浸出粉5g

新鲜配制的0．1％刃天青溶液（或新1．0ml（0．5m1）

配制的0．2％亚甲蓝溶液）

琼脂0．5～0.7g

蒸馏水1000ml

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入蒸馏水中，微温溶解后，调pH至弱碱性，煮沸、滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，用NaOH或盐酸调pH至6．9～7．3，分装，于115℃：

压力蒸汽灭菌：

30min。

3．无菌检验用真菌培养基：

磷酸二氢钾（KH2PO4）1g

硫酸镁（MgSO4·

7H2O）0．5g

蛋白胨5g

葡萄糖lOg

蒸馏水1000m1

除葡萄糖外，上述各成分加入蒸馏水内，微温溶解后，调节pH约6．8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀滤清，用NaOH或盐酸调pH使灭菌后为6．4±

0．2，分装，115℃压力蒸汽灭菌20min备用。