临床生化检验技术PPT格式课件下载.pptx

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设入射光强度为强度为I0，透射光强度为，透射光强度为I，I和和I0之比称为透光度，即：

之比称为透光度，即：

T=I/I0T100为为T%称为百分透光度。

透光度的负对数称为吸光度即：

称为百分透光度。

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（二）

（二）Lambert-Beer定律定律Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。

其厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。

其表达式为：

表达式为：

A=KLC式中式中A为吸光度；

为吸光度；

K为比例常数，称为吸光系数；

为比例常数，称为吸光系数；

L为溶液为溶液层层厚度，称为光径；

厚度，称为光径；

C为溶液浓度为溶液浓度（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光定律适用于可见光、紫外光、红外光和和均匀均匀非散射的液体。

）非散射的液体。

）7据据Lambert-Beer定律，当液层厚度为定律，当液层厚度为cm，浓度单位为，浓度单位为mol/L时，吸光系数时，吸光系数K称为称为摩尔吸光系数摩尔吸光系数（）。

的意义是：

当液层厚度的意义是：

当液层厚度为为1cm，物质浓度为，物质浓度为1mol/L时在特定波长时在特定波长下的吸光度值。

下的吸光度值。

是物质的特征性常数。

8（三）偏离（三）偏离Lambert-Beer定律的因素定律的因素应用应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学定律产生误差主要来源于光学和化学两方面的因素。

和化学两方面的因素。

1光学因素：

光学因素：

要求入射光是单色光。

入射光的谱带越宽，其误差越大。

2化学因素：

化学因素：

浓度、浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。

、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。

9三三、分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构最常用的是最常用的是可见分光光度计可见分光光度计和和紫外紫外-可见光分光光度计可见光分光光度计光源光源单色器单色器比色杯比色杯检测器检测器显示器显示器五大部份五大部份n结构：

结构：

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（一）光源

（一）光源u光源定义：

光源定义：

指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。

光指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。

光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。

变化。

u光源种类：

光源种类：

可见光分光光度计常用光源是可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。

钨灯或卤钨灯。

紫外光光度计常用紫外光光度计常用氢灯氢灯作为光源。

作为光源。

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（二）单色器

（二）单色器u定义：

定义：

将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。

光系统或单色器。

u种类：

种类：

滤光片滤光片棱镜棱镜光栅光栅12（三）比色杯（三）比色杯又称为吸收池或比色皿又称为吸收池或比色皿u材料：

材料：

常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成（五）显示器（五）显示器（四）检测器（四）检测器检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。

常用的检测器为光电管和光电倍增管。

放大的装置。

是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。

装置。

13四四、分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法

（一）分光光度计的基本操作

（一）分光光度计的基本操作以以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：

型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：

1.开开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。

分钟使仪器预热。

2.将波长旋至测定的波长。

将波长旋至测定的波长。

3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。

将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。

4.将开关置于将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为为0.0,关上关上比色池盖子，调节比色池盖子，调节T为为100.0。

5.将开关置于将开关置于A，用消光调零调节，用消光调零调节A为为0.06.重复步骤重复步骤4和和57.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）14

（二）吸光度的校正

（二）吸光度的校正铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。

在度。

在25，将，将4mg铬酸钾溶于铬酸钾溶于100ml的的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波长中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。

行比较，可检测仪器吸光度的准确度。

15五五、分光光度技术的定性和定量方法分光光度技术的定性和定量方法

（一）分光光度技术的定性方法

（一）分光光度技术的定性方法u定性依据：

定性依据：

最大吸收波长最大吸收波长max和摩尔吸光系数和摩尔吸光系数2.摩尔摩尔消光系数消光系数方法方法1.最大吸收波长最大吸收波长max方法方法16

（二）分光光度技术的定量方法

（二）分光光度技术的定量方法1.1.标准曲线法标准曲线法根据根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。

配制一系列浓度的标准品溶液（浓吸光度成正比关系。

配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标座标，以吸光度为纵座标，按最小二乘法的原理，将对，按最小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。

待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相线。

待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。

应的浓度。

u方法：

方法：

17u制作和应用标准曲线时应注意下面几点：

制作和应用标准曲线时应注意下面几点：

（11）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。

绘制。

（22）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。

）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。

（33）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。

）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。

（44）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。

）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。

182比较法比较法Cu=（AuCs）/As己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：

品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：

其中其中Cu和和Au为标本管浓度和吸光度，为标本管浓度和吸光度，Cs和和As分别为标准分别为标准管浓度和吸光度。

用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量管浓度和吸光度。

用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。

和标本管浓度相近。

1933其它分析方法其它分析方法包括差示法、多组份混合物分析和利用包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸摩尔吸光系数光系数分析等方法。

分析等方法。

六、火焰六、火焰光度法光度法（一一）概述概述（二二）仪器仪器装置装置（三三）定量分析定量分析原理原理（四四）定量分析定量分析的方法的方法（五五）影响影响火焰光度法分析结果的因素火焰光度法分析结果的因素（一一）概述概述11、火焰光度法的定义、火焰光度法的定义火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。

方法。

它是一种简化的发射光谱分析法。

2、火焰光度法的特点、火焰光度法的特点设设备备简简单单：

被被测测试试样样易易被被火火焰焰激激发发，产产生生的的谱谱线线较较简简单单，且且均均在在可可见见光光区区，故故使使谱谱线线分分离离和和测测量量的的设备简单。

设备简单。

应用范围窄：

主要用于碱金属和部分碱土金属的测应用范围窄：

主要用于碱金属和部分碱土金属的测定。

定。

快速：

试样溶液于数分钟内可完成测定。

准确：

火焰光源稳定性高，干扰少，误差为准确：

火焰光源稳定性高，干扰少，误差为25，可用于微量分析和常量分析。

，可用于微量分析和常量分析。

灵敏：

分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达灵敏：

分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0110106g。

（二二）仪器装置仪器装置FP640火焰光度计火焰光度法分析示意图火焰光度法分析示意图1.1.光源系统光源系统2.2.光学系统光学系统3.3.检测系统检测系统-用于测定食品中的钠含量、土壤中的钾含量、矿石中的钠钾含量等。

-可同时测定钠、钾离子浓度。

-数据可以通过RS-232接口输出到计算机或打印机。

-测量范围：

钠0-199.9ppm钾0-9.99ppm锂0-9.99ppm-灵敏度：

0.1ppm钠；

K=100单位-重现性：

小于0.5C.V.双通道火焰光度计仪器仪器装置装置光光源源：

包包括括喷喷雾雾器器、雾雾化化室室和和喷喷灯灯。

试试液液经经喷喷雾雾器器分分散散在在压压缩缩空空气气中中成成为为雾雾，然然后后与与可可燃燃气气体体混混合合，在在喷喷灯灯上上燃燃烧烧，待