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（2）用）用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1：

10稀释液稀释液1mL，沿管壁徐，沿管壁徐徐注入含有徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成做成1：

100的稀释液。

的稀释液。

（3）另取）另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支支1mL灭菌吸管。

灭菌吸管。

（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择选择2-3个适宜稀释度，分别在作个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。

度作两个平皿。

（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂营养琼脂培养基培养基可放置在（可放置在（461）水浴锅内保温）水浴锅内保温注入平皿注入平皿15mL-20mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

照。

（6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（）等琼脂凝固后，翻转平板，置（361）恒温箱恒温箱内培养（内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得得1g（1mL）样品所含菌落总数。

）样品所含菌落总数。

l样品稀释程序样品稀释程序l菌落计算方法菌落计算方法

（1）菌落计数方法）菌落计数方法做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的查，以防遗漏。

在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

各平板平均菌落总数。

（2）菌落计数的报告）菌落计数的报告平板菌落数的选择平板菌落数的选择选取菌落数在选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标之间的平板作为菌落总数测定标准。

一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其准。

一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。

平皿内如有链状菌落以代表全皿菌落数。

平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；

如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落数；

如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

个菌落计。

稀释度的选择稀释度的选择应选择平均菌落数在应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。

若有两上稀释度，其生长的菌落数均在倍数报告之。

若有两上稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定。

若其比值小于或等于之间，则视两者之比如何来决定。

若其比值小于或等于2，应报告其平均数；

若大于，应报告其平均数；

若大于2则报告其中较小的数字。

则报告其中较小的数字。

若所有稀释度平均菌落数均大于若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按稀释度最，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度均无菌落生长，则以小于若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释乘以最低稀释倍数报告之。

倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均不在若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中之间，其中一部分大于一部分大于300或小于或小于30时，则以最接近时，则以最接近30或或300的平均菌落的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

数乘以稀释倍数报告之。

菌落数的报告菌落数的报告菌落数在菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于以内时，按其实有数报告，大于100时，采时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。

为了缩短数字后面的零数，也可用方法计算。

为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表的指数来表示。

示。

l其他检验方法其他检验方法1.涂布平板法涂布平板法2.点滴平板法点滴平板法与涂布平板法相似。

不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴（使每滴相当于0025m1）将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域（预先在乎板背面用标记笔划成四个区域）。

四、大肠菌群检验四、大肠菌群检验1.大肠菌群概念大肠菌群概念大肠菌群系指一群在37度能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。

从种类上讲，大肠菌举包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等以埃希氏菌属为主，大肠菌群MPN是指在100ml（或100g）食品检样中听含的大肠菌群的最近似或最可能数。

2.2.大肠菌群指示作用大肠菌群指示作用作为（判断食品是否被肠道致病菌所污染及污染程度的）指示菌的条件：

和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检出。

在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长。

检验方法比较简便。

大肠菌群在数量和检验方面均符合指示菌的三项要求，3.大肠菌群数量的表示方法大肠菌群数量的表示方法1）大肠菌群MPN大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值；

2）大肠菌群值。

大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。

故大肠菌群值越大，表示食品中所含的大肠菌群细菌的数量越少，食品的卫生质量也就越好：

在这两种表示方法中，目前国内外普遍采用大肠菌群MPN，而大肠菌群值逐渐趋于不用。

4.大肠菌群检验方法大肠菌群检验方法

（1）检样稀释）检样稀释1）以无菌操作将检样25mL（或25g）放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：

固体检样最好用匀质器。

以8000-10000转分钟的速度处理1分钟，做成1：

2）用1mL灭菌吸管吸取1：

10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作1：

10的稀释液。

3）另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管：

4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。

（2）乳糖发酵试验）乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；

1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36+1温箱内，培养24+2小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。

如有产气者，按下列程序进行。

（3）分离培养）分离培养将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上，置361温箱内培养1824小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

（4）证实试验）证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色。

同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养24+2小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

（5）报告）报告根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的最近似数（MPN）。

5.其他方法其他方法l疏水网膜法lTTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）显色法lDC（去氧胆酸钠）半固体法l纸片法。

五、病原菌检验五、病原菌检验食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。

总之，与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可能污染食品。

（以乳制品为例）1、能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物。

沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。

2、能产生毒素并引起食物中毒的微生物。

肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。