第五章基因治疗_精品文档PPT格式课件下载.ppt

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第一例正式批准的基因治疗实验开始进行实验开始进行（美国美国，世界上开展基因治疗最早的国家），世界上开展基因治疗最早的国家）大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段：

段：

体外试验和动物试验体外试验和动物试验I期临床试验期临床试验6-10名志愿者名志愿者II期临床试验期临床试验20-30名志愿者名志愿者III期临床试验期临床试验充分分析疗效、安全性充分分析疗效、安全性中国：

中国：

1991年年7月开始进行基因治疗试验月开始进行基因治疗试验2.基因治疗发展简史基因治疗发展简史世世界界上上第第一一个个正正式式被被批批准准用用于于基基因因治治疗疗的的病病例例是是先先天天性性腺腺苷苷脱脱氨氨酶酶（ADAADA）缺乏症缺乏症。

19901990年年99月月美美国国BlaeseBlaese博博士士成成功功地地将将正正常常的的人人的的ADAADA基基因因植植入入ADAADA缺缺乏乏症症病病人人的的淋淋巴巴结结内内，完完成成世世界界上上首首例例基基因因治治疗疗试验。

试验。

腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶（ADA）（ADA）缺乏的缺乏的严重联合免疫缺陷严重联合免疫缺陷（SCID）（SCID）病因:

淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年n第一个基因临床治疗的方案（1990.9.14,NIH）n治疗策略：

n淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能改善病人症状治疗基本步骤治疗基本步骤:

ADA基因基因+逆转录病毒载体逆转录病毒载体导入患者导入患者淋巴细胞淋巴细胞体外扩增体外扩增回输回输病人体内病人体内淋巴细胞淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能维持免疫系统功能,改善病人症状改善病人症状一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略TheStrategyofGeneTherapy

（一）基因置换

（一）基因置换（genereplacementgenereplacement）定义：

定义：

指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有置换基因组内原有的缺陷基因的缺陷基因。

目的目的：

将缺陷基因的异常序列进行矫正将缺陷基因的异常序列进行矫正。

对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。

不涉及基因组的任何改变。

又称为又称为基因打靶基因打靶（genetargeting）定定点点整整合合的的条条件件:

转转导导基基因因的的载载体体与与染染色色体体上上的的DNA具具有有相相同同的的序序列列。

带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组的的位位点点，进进行行部部分分基基因因序序列列的的交交换换，使使基基因因置置换换这这一一治疗策略得以实现。

治疗策略得以实现。

基因同源重组技术基因同源重组技术要要实实现现基基因因置置换换，需需要要采采用用同同源源重重组组技技术术使使相相应应的的正正常常基基因因定定向向导导入入受受体体细细胞胞的基因缺陷部位。

的基因缺陷部位。

n定定向向导导入入的的发发生生率率约约1/1001/100万万，采采用用胚胚胎胎干干细细胞胞培培养养的的方方法法，这这种种同同源源重重组组的的检出率最高可达检出率最高可达1/101/10。

基因置换必要条件：

1、对导入的基因及其产物有详尽的了解、对导入的基因及其产物有详尽的了解2、外来基因能有效地导入靶细胞、外来基因能有效地导入靶细胞3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在4、导入基因能有适度水平的表达、导入基因能有适度水平的表达5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害无害

（二）

（二）基因添加基因添加基因添加基因添加或称或称基因增补基因增补（geneaugmentationgeneaugmentation）:

通过导入外源基因通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的使靶细胞表达其本身不表达的基因。

基因。

类型类型:

n在在有有缺缺陷陷基基因因的的细细胞胞中中导导入入相相应应的的正正常常基基因因，而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，通通过过导导入入正正常常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；

基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；

n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，利利用其表达产物达到治疗疾病的目的。

用其表达产物达到治疗疾病的目的。

基因干预基因干预（geneinterferencegeneinterference）指采用特定的方式抑制某个基因的表达，指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。

治疗疾病的目的。

1.反义核酸反义核酸：

封闭基因表达封闭基因表达2.核酶：

核酶：

裂解特异的靶裂解特异的靶mRNA3.RNA干涉技术：

干涉技术：

（三）基因干预（三）基因干预（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗自自杀杀基基因因治治疗疗:

恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的主主要方法之一。

要方法之一。

原原理理:

将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达达到到清清除除肿肿瘤瘤细细胞的目的。

胞的目的。

自杀基因的作用机制1.1.自杀基因系统自杀基因系统TK/GCVTK/GCV单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（herpssimplexvirus,herpssimplexvirus,HSVHSV）型胸苷激酶型胸苷激酶（thymidinekinase,thymidinekinase,tktk）基）基因编码胸苷激酶，因编码胸苷激酶，胸苷激酶胸苷激酶特异性地将无毒的核苷类似物特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷丙氧鸟苷（ganciclovir,ganciclovir,GCVGCV）转变成）转变成毒性毒性GCVGCV三磷酸核苷三磷酸核苷，后者能抑制后者能抑制DNADNA聚合酶活性，导致细胞死亡。

聚合酶活性，导致细胞死亡。

CD/5-FCCD/5-FC大肠杆菌大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶（cytosinecytosinedeaminase,deaminase,CDCD）基因，）基因，胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶在细胞内将无毒性在细胞内将无毒性5-5-氟胞嘧啶氟胞嘧啶（5-FC5-FC）转变成毒性产物）转变成毒性产物5-5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU5-FU）。

）。

5-5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶通过竞争性抑制通过竞争性抑制胸苷酸合酶胸苷酸合酶的活性，的活性，从而从而抑制脱氧胸苷三磷酸抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。

的合成。

旁旁观观者者效效应应:

“自自杀杀基基因因”治治疗疗不不仅仅使使转转导导了了“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死，而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞也被杀死。

胞也被杀死。

2.2.旁观者效应旁观者效应（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强细胞因子或通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHCMHC基因基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。

免疫反应。

二、基因治疗的必要条件二、基因治疗的必要条件1.发病机制在发病机制在DNA水平上已经清楚；

水平上已经清楚；

2.要转移的基因已经克隆分离，其表达产要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解；

物有详尽的了解；

3.该基因正常表达的组织可在体外进行遗该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作；

传操作；

1.外源基因可有效导入靶细胞外源基因可有效导入靶细胞2.外源基因能在靶细胞中长期稳定存留外源基因能在靶细胞中长期稳定存留3.导入基因能适量表达导入基因能适量表达4.导入基因的方法及载体对宿主细胞安全导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害无害理想的基因治疗还必须：

理想的基因治疗还必须：

二、基因转移技术二、基因转移技术TheTechniqueofGeneTransfer基因治疗途径基因治疗途径1、间接体内治疗途径（、间接体内治疗途径（exvivo）是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。

（安全、增培养，以一定数量移植患者体内。

（安全、易控制但操作复杂）易控制但操作复杂）22、直接体内治疗途径（、直接体内治疗途径（invivoinvivo）将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。

（操作简必须具有特异的导向性和转移效率。

（操作简单但疗效短、免疫排斥等）单但疗效短、免疫排斥等）基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因invivoexvivo靶细胞基因转移基因转移（genetransfer）（genetransfer）技术：

技术：

1.1.病毒介导的基因转移系统。

病毒介导的基因转移系统。

2.2.非病毒介导的基因转移系统非病毒介导的基因转移系统。

1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。

因此它也是使用最多的基因治疗载体。

据统计，有据统计，有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的的病例使用了病毒载体，其中用得最多的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是是逆转录病毒载体逆转录病毒载体。

具有包膜，圆球状，直径为具有包膜，圆球状，直径为8080120nm120nm基因组是基因组是单正链单正链RNARNA，3.53.59.0kb9.0kb病毒颗粒中有病毒颗粒中有逆转录酶逆转录酶能整合于宿主细胞的染色体能整合于宿主细胞的染色体（11）逆转录病毒）逆转录病毒（Retroviruses）逆转录病毒颗粒结构逆转录病毒颗粒结构RNA逆转录酶逆转录酶衣壳蛋白衣壳蛋白基质蛋白基质蛋白包膜包膜gp120gp41ReversetranscriptionIntegrationTranscriptionPackagingLifecycleofretrovirus逆转录病毒逆转录病毒整合入宿主整合入宿主DNADNA中的分子机制，其本质是中的分子机制，其本质是转座转座LTR（long-terminalrepeat）:

长末端重复序列长末端重复序列Provirus（原病毒原病毒）:

被被整合整合到细胞基因组中的逆到细胞基因组中的逆转