未培养和极端微生物_精品文档PPT资料.ppt

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古菌中新的一界N.equitansIgnicoccus99%的微生物尚属未知Amann,Ludwig&

Schleifer,Microbiol.Rev.59:

143（1995）一个“看不见”的事实微生物：

分布最广界定生物圈范围生物量最大占总生物量的60%物种及代谢多样性最为丰富一个重要的认识一个重要的认识自然界中已知微生物仅占总数的不到1%。

“未知微生物或许是地球上最大的尚未开发的自然资源。

”JamesStanley未培养微生物未培养微生物（unculturedmicroorganisms）:

无法采用现有常规方法在实验室里培养的微生物。

常规方法：

温度范围：

10-70；

压力范围：

常压条件；

pH范围：

2-10；

耐盐范围：

低盐范围共同协作的自然生存方式的崩溃共同协作的自然生存方式的崩溃互养和共代谢，共栖、互生与共生；

互养和共代谢，共栖、互生与共生；

急剧改变的生态位急剧改变的生态位大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需要提供其群落中的小生态环境，即生态位；

要提供其群落中的小生态环境，即生态位；

1、未培养微生物存在的生态原因、未培养微生物存在的生态原因生长环境的极度营养变化生长环境的极度营养变化对环境资源高亲和性的对环境资源高亲和性的K型，适应低营养含量型，适应低营养含量和极低的生长率；

和极低的生长率；

潜在外源活性物质的缺乏潜在外源活性物质的缺乏纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质；

性物质；

1、未培养微生物存在的生态原因、未培养微生物存在的生态原因2.12.1宏基因组技术宏基因组技术基本思路是直接提取环境微生物的总基因组基本思路是直接提取环境微生物的总基因组DNA,用用核酸内切酶进行部分消化核酸内切酶进行部分消化,再与载体连接再与载体连接,转入宿主细胞转入宿主细胞,构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克隆；

隆；

优点优点：

不受已知基因的同源性序列的限制不受已知基因的同源性序列的限制,因而所获得的基因而所获得的基因往往结构很新颖；

因往往结构很新颖；

2、未培养微生物的分子生物学研究方法、未培养微生物的分子生物学研究方法实实例例Rondon等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土壤未培养微生物基因组文库，筛选到壤未培养微生物基因组文库，筛选到41个分别编码脂肪个分别编码脂肪酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，DNA序列与已知序列有很大的差异，其中一个编码的抗序列与已知序列有很大的差异，其中一个编码的抗菌肽结构属于新的基因家族菌肽结构属于新的基因家族；

传统培养和宏基因组流程比较2.22.2遗传指纹图谱技术遗传指纹图谱技术核酸指纹图谱技术即核酸指纹图谱技术即DNA指纹图谱法是指纹图谱法是1985年由年由Jeffreys等等提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交取得不同大小的取得不同大小的DNA片段的多点区带图谱，并与另一个片段的多点区带图谱，并与另一个DNA图图谱比较以评价其相似性的技术。

谱比较以评价其相似性的技术。

不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响，允许同时进行多不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响，允许同时进行多样本分析；

样本分析；

缺点缺点：

过于依赖内切酶的选用过于依赖内切酶的选用，且，且方法繁杂方法繁杂、周期长周期长、实验条件高实验条件高等缺陷而无法大范围推广等缺陷而无法大范围推广；

方法方法：

梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等3.13.1用低浓度的培养基来进行分离培养用低浓度的培养基来进行分离培养一般认为一般认为,传统的培养基营养太丰富传统的培养基营养太丰富,不适合于那些原先生长不适合于那些原先生长在缺乏营养的环境中的微生物在缺乏营养的环境中的微生物,如海洋微生物；

如海洋微生物；

实例实例1：

Connon等用比实验室中常用的培养基营养低等用比实验室中常用的培养基营养低3个数量级个数量级,小小体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。

从体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。

从11个样品中个样品中分离出分离出20500个培养物，其中有个培养物，其中有4个单细胞系是以前从未培养过、个单细胞系是以前从未培养过、也从未描述过的。

通过这种方法，使海洋样品中浮游细菌的可也从未描述过的。

通过这种方法，使海洋样品中浮游细菌的可培养率提高到培养率提高到14%，比以前提高了，比以前提高了141400倍。

倍。

3、未培养微生物的可培养方法、未培养微生物的可培养方法让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸提物和海水滤过液来制作培养基提物和海水滤过液来制作培养基,该方法已趋成熟该方法已趋成熟；

实例2：

ZenglerK等设计了一个非常精妙的方法等设计了一个非常精妙的方法，将细胞包埋在将细胞包埋在凝胶微滴板中凝胶微滴板中，在低营养的流动培养液中进行培养在低营养的流动培养液中进行培养，再用流再用流动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆。

这是一个开这是一个开放流动的系统放流动的系统，微生物间的代谢产物及信号分子可在凝胶空微生物间的代谢产物及信号分子可在凝胶空隙中进行扩散而被其他菌利用。

这与自然环境有很多的相似隙中进行扩散而被其他菌利用。

这与自然环境有很多的相似之处之处，因而新培养出来的微生物种类也大大增加。

因而新培养出来的微生物种类也大大增加。

这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境；

3.2根据微生物特性根据微生物特性特异添加营养成分变成可培养特异添加营养成分变成可培养实例实例1：

Kashefi等根据嗜高热微生物利用等根据嗜高热微生物利用Fe（III）作为终端电子受作为终端电子受体这一高度保守的特性体这一高度保守的特性，在培养基中添加非常微量的在培养基中添加非常微量的Fe（III）氧化物。

氧化物。

该该方法的前提是对微生物特性有一定的了解方法的前提是对微生物特性有一定的了解。

实例实例2：

Santini等从澳大利亚金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧等从澳大利亚金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧为受体，以为受体，以CO2为唯一碳源的化能自养菌（为唯一碳源的化能自养菌（NT-26）。

）。

16SrDNA序列分析表明，序列分析表明，NT-26属于属于-Proteobacteria土壤土壤杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。

杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。

环境样品混合基因组DNADNA文库目标基因/基因簇细胞破碎、DNA提取克隆活性筛选同源筛选未培养微生物基因资源的开发基于培养非依赖（culture-independent）技术的尝试克隆酶生物活性物质PCR1.环境样品DNA的提取和纯化细胞收集法Agaroseplug直接裂解法物理法：

研磨、超声波、冻融、beadbeating化学法：

溶菌酶、ProteinaseK、SDS、酚等DNA提取DNA纯化CTAB、PVPPCsCl密度梯度离心、电洗脱、柱层析等2.文库筛选测序/基因注释活性筛选常规活性检测基于BAC的功能基因组学平台同源筛选PCR方法、分子杂交微排列技术、DNA芯片DNA产量和回收率产量和回收率国内研究实例国内研究实例1王啸波等，微生物学报，王啸波等，微生物学报，20012001，4141（22）：

）：

133-140133-140RestrictiondigestionofthreepurifiedenvironmentalDNAsamples分离自环境样品的纯化DNA的酶切试验Sizedistributionofinsertsinrandomlyselectedclones腾冲热泉试验文库：

库容约1Mb；

插入片段为3-8kb环境样品DNA文库构建环境样品DNA文库的初步评估GeneannotationofpartialDNAsequencesderivedfrominsertsinrandomlyselectedclones20个随机克隆插入片段12个可预测功能开放阅读框序列均未见报道研究结果简要分析研究结果简要分析20个测序样品中，14个为新序列；

14个序列中12个含可预测功能的基因；

样品e6含编码硫氧蛋白还原酶基因一部分；

样品9918含蛋白二硫键异构酶基因一部分；

为相关酶的性能改造提供基础Davies的工作（1997）土壤样品混合基因组DNAPolyketidesynthase基因PCR国外研究实例1J.Davies（1997）从土壤中直接获得全长KSb基因的策略J.Davies（1997）KSa和KSb基因产物的系统发育学关系Handelsman和Goodman的工作（1998）土壤样品混合基因组DNA元基因组文库（BAC文库）酶、小分子活性物质元基因组（metagenome）:

环境中所有微生物基因组的总和。

国外研究实例2Handelsman&

Goodman（1998）两个土壤元基因组文库（库容：

1Gbp）Handelsman&

Goodman（1998）Handelsman&

Goodman（1998）未培养微生物系统发育学分析与生物学分析的偶联基因簇的克隆Handelsman&

Goodman（1998）Osburneetal.（2000）抗细菌活性的筛选Diversa公司（1995-）未培养微生物基因资源大规模开发的先驱采集全球各种生态环境样品高效筛选新基因、基因簇针对不同应用需要优化基因及基因簇获得高效、高稳定性酶和小分子生物活性物质5,000genomes109clones108109clone.assays/dayDiversa产品“酶订购计划”数百种新酶ThermalAceDNApolymerase（由Invitrogen销售）Replicase微生物世界的淘金者DiversaARIADPharmaceuticals,Inc.TerraGenDiscovery,Inc.KhosanBiosciences,Inc.Maxygen,Inc.新世纪的挑战新世纪的挑战任务：

了解自然界中微生物的种类、相互作任务：

了解自然界中微生物的种类、相互作用、对环境的影响；

开发微生物资源用、对环境的影响；

开发微生物资源解决方案解决方案代表性生态环境的系统生态学研究代表性生态环境的系统生态学研究发展新的富集培养和分离策略，结合采用分子发展新的富集培养和分离策略，结合采用分子生物学和培养依赖方法，研究未培养微生物生物学和培养依赖方法，研究未培养微生物微生物系统科学：

微生物系统科学：

技术集成、学科集成技术集成、学科集成极端微生物及其生物技术价值极端微生物及其生物技术价值第二部分第二部分一、极端微生物的概念研究的需求：

研究的需求：

许许多多工工业业过过程程需需要要高高压压、高高温温、低低温温、高高盐盐碱碱或或耐耐