基因测序原理_精品文档PPT推荐.ppt

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要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。

Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize（Mb）什么是什么是C值？

值？

通常是指一种生物通常是指一种生物单倍体基因组单倍体基因组DNADNA的的总量总量.在真核生物中，在真核生物中，CC值一般随着生物的进化而值一般随着生物的进化而增加，高等生物增加，高等生物CC值一般大于低等生物。

值一般大于低等生物。

C值悖理：

值悖理：

生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加例增加细菌细菌细菌细菌真菌真菌真菌真菌等等等等动物动物动物动物阴影部分为一个门内阴影部分为一个门内C-值的范围值的范围重复顺序重复顺序高度重复顺序：

高度重复顺序：

长度：

几个长度：

几个几千个几千个bp拷贝数：

几百个拷贝数：

几百个上百万个上百万个首尾相连，串联排列首尾相连，串联排列集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等）集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等）也称卫星也称卫星DNA中度重复顺序：

中度重复顺序：

一般分散于整个基因组中；

长度和拷贝数差别很大长度和拷贝数差别很大单一顺序：

单一顺序：

基因主要位于单一顺序基因主要位于单一顺序动物中单一顺序约占动物中单一顺序约占50植物中单一顺序约占植物中单一顺序约占20DNA的复性的复性遵循二级反应动力学，可表述为：

遵循二级反应动力学，可表述为：

dCt/dt=-KC02反应达反应达t时，单链时，单链DNA浓度浓度=CtC0=单链单链DNA起始浓度起始浓度K复性速度常数复性速度常数顺序复杂性Cot（1/2）=1/K（mol.Sec/L）常数常数Ct/C00101C0t（1/2）C0t（1/2）C0t（1/2）值与值与基因组复杂性成正比。

基因组复杂性成正比。

是遗传信息的物理和功能单位，包含是遗传信息的物理和功能单位，包含产生产生一条多肽链或功能一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸所必需的全部核苷酸序列。

序列。

基因分类：

编码编码RNA的基因，如的基因，如rRNA基因，基因，snRNA基因等；

基因等；

编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因2.什么是基因？

什么是基因？

基因的不连续性基因的不连续性Intron和和Exon:

大多数真核生物蛋大多数真核生物蛋白质基因的编码顺白质基因的编码顺序序（Exon）都被或长都被或长或短的非编码顺序或短的非编码顺序（Intron）隔开隔开基因家族基因家族一群具有一群具有一致的一致的或或相似相似顺序顺序的基因的基因,有的还担负有的还担负类似的生物学功能类似的生物学功能,可以相互补偿可以相互补偿,比如比如:

E2fE2ftranscriptionfactortranscriptionfactorMousesymbolMousesymbolHumanHumanOrthologOrthologE2f1E2f1E2F1E2F1E2f2E2f2E2F2E2F2E2f3E2f3E2F3E2F3E2f4E2f4E2F4E2F4E2f5E2f5E2F5E2F5E2f6E2f6E2F6E2F6假基因假基因（Pseudogene）来源于功能基因来源于功能基因但已失去活性但已失去活性的的DNA序列序列产生假基因的原因有产生假基因的原因有:

1.由重复产生的假基因由重复产生的假基因;

2.加工的假基因加工的假基因,由由RNA反转录为反转录为cDNA后再整后再整合到基因组中合到基因组中;

3.残缺的基因残缺的基因（Truncatedgene）重叠基因重叠基因:

同一段同一段DNA能携带两种不同蛋白的信息能携带两种不同蛋白的信息.重迭基因有以下几种情况：

重迭基因有以下几种情况：

*一个基因完全在另一个基因内部一个基因完全在另一个基因内部*部分重叠部分重叠*两个基因共用少数碱基对两个基因共用少数碱基对*一个基因完全在另一个一个基因完全在另一个基因内部基因内部如：

如：

B和和A，E和和D其读码结构互不相同其读码结构互不相同-ATG-/-AATGCC-/-ATAACG-/-TAA-A*BATGCCN-NNATAA*部分重叠部分重叠如：

K和和C*两个基因共用少数两个基因共用少数碱基对碱基对如：

D和和J-TAATG-D终止密码子终止密码子J起始密码子起始密码子3.DNA测序的方法nn链终止法测序链终止法测序nn化学降解法测序化学降解法测序nn自动化测序自动化测序nn非常规非常规DNADNA测序测序3.13.1链终止法测序链终止法测序（thechaintermination（thechainterminationmethod）method）基本原理基本原理:

通过合成与单链通过合成与单链DNADNA互补的多核苷酸链，互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的应，产生只差一个核苷酸的DNADNA分子，从而分子，从而来读取待测来读取待测DNADNA分子的顺序。

分子的顺序。

技术路线与要求技术路线与要求制备单链模板制备单链模板将将单链单链模板与一小段引物退火模板与一小段引物退火加入加入DNADNA多聚多聚酶酶44种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸分分别别加入少量加入少量44种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸将将44种反种反应产应产物分物分别别在在44条泳道条泳道电电泳泳根据根据44个碱基在个碱基在44条泳道的条泳道的终终止位置止位置读读出基因序列出基因序列A克隆于质粒中DNA用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活性B无53外切酶活性C无35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基3.2化学降解法测序nn基本原理:

在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.技术路线技术路线将双将双链链DNADNA样品变为单链样品变为单链每个每个单链单链的同一方向末端都用放射性同位素的同一方向末端都用放射性同位素标记标记,以便以便显显示示DNADNA条条带带分分别别用不同方法用不同方法处处理理,获获得只差一个核苷酸的得只差一个核苷酸的降降解解DNADNA群体群体电电泳泳,读读取取DNADNA的核苷酸的核苷酸顺顺序序MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert法所用的化学技术法所用的化学技术碱基碱基特异修饰方法特异修饰方法GGPh8.0,Ph8.0,用硫酸二甲酯对用硫酸二甲酯对N7N7进行甲基化进行甲基化,使使C8-C9C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性键对碱基裂解有特殊敏感性A+GA+GpH2.0pH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的哌啶甲酸可使嘌呤环的NN原子化原子化,从从而导致脱嘌呤而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键的糖苷键C+TC+T肼可打开嘧啶环肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后后者重新环化成五元环后易除去易除去CC1.51.5mol/Lmol/LNaClNaCl存在时存在时,可用肼除去胞嘧啶可用肼除去胞嘧啶化学法测序实例化学法测序实例哌啶3.33.3自动化测序自动化测序nn基本原理与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.3.43.4非常规测序非常规测序nn毛细管电泳毛细管电泳用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时节省时间间,加快测序进程加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法其他程序同链终止法或化学测序法.nn光点测序光点测序脱氧三磷酸核苷酸脱氧三磷酸核苷酸连接到连接到DNA3-DNA3-末端末端时会释放时会释放11个焦磷酸个焦磷酸（PPiPPi）,焦磷酸焦磷酸在在磷酸化酶磷酸化酶的作用下转化为的作用下转化为化学能化学能,并发出光亮并发出光亮.由此由此,往反应液中每次只加入往反应液中每次只加入11种核苷酸种核苷酸,当加入的核苷酸结合时当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点反应液发出亮点,并记录核苷酸种类并记录核苷酸种类;

当核苷酸未结合时当核苷酸未结合时,反应液中的核反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定由此来测定DNADNA序列序列.nnDNA芯片测序基本原理基本原理将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的待检测的DNADNA分子与芯片温浴分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装序进行对比组装,拼接成完全的拼接成完全的DNADNA顺序顺序.利用基因芯片进行杂交测序的原理44序列的组装序列的组装4.14.1随机测序与序列组装随机测序与序列组装随机测序也称随机测序也称”鸟枪法鸟枪法”.序列组装原理序列组装原理:

直接从已测序的小片段中寻找彼直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸然后依次向两侧邻接的序列延伸.优点优点:

不需预先了解任何基因组的情况不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装ABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装鸟枪法鸟枪法（Shotgun）测序的问题测序的问题CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP错装错装实例实例:

流感嗜血杆菌基因组的测序及流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装顺序组装超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组DNADNA琼琼脂糖脂糖电电泳收集泳收集1.61.62.0Kb2.0Kb的区段的区段、纯化纯化构建到质粒载体中构建到质粒载体中随机挑选随机挑选1968719687个克隆个克隆,进行进行2864328643次测序次测序,得到可读顺序得到可读顺序为为1163148511631485bpbp组装成组装成140140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群,各重叠群间仍有间隙各重叠群间仍有间隙顺序间隙顺序间隙物理间隙物理间隙载体或宿主菌载体或宿主菌选用不当而被丢失选用不当而被丢失的顺序的顺序测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序解决办法:

通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库解决办法:

利用其它宿主菌与载体重新构建文库4.24.2限制测序限制测序nn限制测序：

是指将一段染色体区段的限制测序：

是指将一段染色体区段的DNADNA顺顺序进行组装序进行组装.一些已绘制了遗