腺病毒载体的构建Word格式.docx
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人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。
4.1.2主要试剂
限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司;
内切酶PmeI和PacI购自NEB公司;
pMDTM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司;
穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司;
琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司;
λ/HindIIIMarker购自天根公司;
OptiMem优化培养液购自Gibico公司;
脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。
载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成,其余材料和试剂来源同3.1。
4.2试验方法
4.2.1SOCS2基因克隆
4.2.1.1组织中总RNA提取
根据TakaraRNAisoPlus试剂说明提取组织中总RNA:
4.2.1.2cDNA第一链合成
同3.2.6
提取的总RNA反转录为总cDNA,表3-1为反应体系和操作流程:
表3-1cDNA第一链合成体系及操作过程
Table3-1RevertAidTMFirstStrandcDNASythesissystemandoperationprotocol
反转录合成cDNA第一链
总RNA
1.5μL
Primer:
Oligo(dT)18primer
1μL
DEPC处理水
9.5μL
轻微震荡混匀,65℃孵育5min,冰上冷却2min;
瞬时离心收集反应液,置于冰上,按顺序加入以下试剂:
5×
反应缓冲液
4μL
RiboLockTM核糖核酸酶抑制剂(20u/μL)
10MmdNTPs混合物
2μL
RevertAidTMM-MuLV反转录酶(200u/μL)
瞬时离心收集反应液,25℃孵育5min,42℃孵育60min;
70℃5min终止反应,反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。
4.2.1.3SOCS2基因编码区(CDS)的扩增
依照扩增CDS全长的引物设计原则,根据Genbank公布的SOCS2基因序列(NM_007706.3),用PrimerPremier5.0软件设计SOCS2扩增引物,表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。
表4-1SOCS2CDS区扩增引物
Table4-1PrimersofSOCS2CDSsequence
Primernames
Primersequence(5-3)
SOCS2-F:
CGTGTTGACTCATCTCCC
SOCS2-R
CATAGCTGCATTCGGAGA
SOCS2-F-BglⅡ
GCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGG
SOCS2-R-Flag-XhoⅠ
GCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT
TGTAATCTACCTGGAATTTATATTCTT
4.2.1.4SOCS2CDS区的扩增体系和条件
用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物,按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2CDS区。
表4-2SOCS2CDS区的扩增体系和条件
Table4-2PCRamplificationsystemand
10×
PCR缓冲液
1.25μL
dNTPMixture(各2.5mM)
上、下游引物(10μM)
各0.5μL
cDNA
1.3μL
ddH2O
7.45μL
瞬时离心收集反应液,按一下条件进行反应:
预变性(95℃)
5min
反应一:
(20个循环)
变性(95℃)
40s
退货(62℃,每个循环降0.5℃,共20循环)
延伸(72℃)
50s
反应二:
退火(57℃)
反应三:
8min
反应结束后,样品直接用于电泳检测,或暂时存放于4℃,-20℃可存放一周
4.2.1.6SOCS2CDS区的T载体克隆及鉴定
依照TakarapMDTM18-T克隆载体操作说明,将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMDTM18-T;
A.克隆反应体系和操作步骤如下表,样品添加及试剂融解均在冰上操作;
pMD18-T(50ng/μL)
插入的目的片段(0.1-0.3pmol)
3.5μL
dH2O
0.5μL
SolutionⅠ
5μL
B.瞬时离心,收集反应液。
16℃孵育过夜(>
12h);
将连接产物10μL加入到100μLDH5α感态中,冰浴30min;
C.42℃热击45s,迅速冰浴1min,此过程不可激烈晃动PCR管,否则影响转化效率;
D.加入1mLLB无抗性培养液,37℃、200rpm震荡培养1h;
E.室温、4000rpm离心5min,收集菌体;
吸弃900μL培养液上清,用枪头吹打100μL余液,重悬菌体;
F.无菌条件下,将100μL菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板,37℃倒置培养;
E.培养约12h,无菌条件下,挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中,37℃、250rpm震荡培养过夜,提取穿梭质粒进行PCR检测;
阳性克隆送至金斯瑞公司测序。
4.2.2DH5α感受态的制备(CaCl2)
无菌条件下,将冻存的DH5α划线接种于无抗性的LB固体平板上,37℃倒置、过夜培养,选取生长良好的单克隆接种于100mL无抗性的LB液体培养液中,于37℃、250rpm,震荡培养过夜(约16h);
A.从中吸取1mL菌液接种于100mL无抗性的新鲜培养液,37℃、250~300rpm培养2~3h,从2h开始不断对菌液测ODλ=600值,直至0.4≤ODλ=600≤0.6(0.45为最适OD值);
B.以下步骤必须均需无菌冰上操作,0.1MCaCl2和含15~20%甘油的0.1MCaCl2需要预冷处理;
C.取30mL菌液于50mL离心管,冰上冷却10min;
D.4℃4500rpm离心5min收集菌体;
加3mL0.1MCaCl2溶液,枪头轻轻吹打,使菌体悬浮,冰上放置20min;
E.4℃4500rpm离心5min,收集菌体;
加3mL含15~20%甘油的0.1MCaCl2,枪头吹打混匀菌体;
每100μL分装一管,-80℃冻存。
4.2.3质粒转化
A.-80℃冻存的感受态,冰上融化或室温融化后立即置于冰上;
B.向100μL感受态中加入连接产物(含量≤50ng,体积≤10μL),摇匀,冰上静止30min;
C.42℃水浴热激90s,或37℃水浴5min,热击后迅速置于冰上,静止5min;
操作过程不要有激烈摇动;
C.向离心管中加1mL无抗性LB培养基,混匀后,37℃250rpm振荡培养1h,细菌恢复正常生长,抗性基因开始表达;
D.将上述菌液4000rpm离心5min,弃去1mL上清,重悬菌体,菌液均匀涂于含相应抗性的LB固体平板,放置30min后,37℃倒置培养过夜。
4.2.4质粒的小量提取
挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中,37℃300rpm激烈振荡培养12~16h,获得的新鲜菌液依照OmegaE.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒,所有步骤均在室温下操作。
4.2.5重组穿梭穿梭质粒的构建
4.2.5.1SOCS2CDS区的PCR扩增和回收
以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板,表4-1中SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-Flag-XhoⅠ分别为上游和下游引物,按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2,所用引物带有所需要的酶切位点(下划线部分)和Flag标签(斜体部分)。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测,切取含目的片段的胶块,按4.2.5步骤回收PCR产物,微量定量仪测定浓度待用。
4.2.5.2SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收
以微量定量仪测定的浓度为参照,按下列体系对目的DNA进行BglⅡ和XhoⅠ的双酶切,穿梭质粒酶切体系:
Buffer
pAdTrack-CMV(0.5~1μg/μL)
6μL
BglⅡ
0.6μL
XhoⅠ
dH2O
10.8μL
SOCS2PCR产物酶切体系:
SOCS2
11μL
15μL
瞬时离心收集反应液,37℃孵育5h,产物进行1%琼脂糖电泳,将酶切的获得的目的条带切下,按4.2.5步骤回收双酶切的DNA,测定浓度备用。
4.2.5.3SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接
将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度,目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:
1的摩尔比混合,T4连接酶连接,连接体系如下:
2.5μL
SOCS2CDS(约0.3pmol)
5.5μL
CMV(约0.03pmol)
0.7μL
T4连接酶(350U/μL)
15.3μL
瞬时离心收集反应液,16℃孵育过夜,取10μL连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿梭质粒转化DH5α感受态,于含Kan(100μg/mL)的固体LB平板,37℃倒置培养过夜。
挑取生长良好的单克隆,于含15mLKan(100μg/mL)的LB液体培养基,37℃摇菌过夜,培养液浑浊后,取800μL菌液甘油(15~20%)冻存备用,其余用于穿梭质粒提取和后期检测。
4.2.5.4重组穿梭质粒的菌落PCR鉴定
取10μL单克隆摇菌获得的菌液,用