腺病毒载体的构建Word格式.docx

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人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。

4.1.2主要试剂

限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司；

内切酶PmeI和PacI购自NEB公司；

pMDTM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司；

穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；

λ/HindIIIMarker购自天根公司；

OptiMem优化培养液购自Gibico公司；

脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同3.1。

4.2试验方法

4.2.1SOCS2基因克隆

4.2.1.1组织中总RNA提取

根据TakaraRNAisoPlus试剂说明提取组织中总RNA：

4.2.1.2cDNA第一链合成

同3.2.6

提取的总RNA反转录为总cDNA，表3-1为反应体系和操作流程：

表3-1cDNA第一链合成体系及操作过程

Table3-1RevertAidTMFirstStrandcDNASythesissystemandoperationprotocol

反转录合成cDNA第一链

总RNA

1.5μL

Primer：

Oligo（dT）18primer

1μL

DEPC处理水

9.5μL

轻微震荡混匀，65℃孵育5min，冰上冷却2min；

瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：

5×

反应缓冲液

4μL

RiboLockTM核糖核酸酶抑制剂（20u/μL）

10MmdNTPs混合物

2μL

RevertAidTMM-MuLV反转录酶（200u/μL）

瞬时离心收集反应液，25℃孵育5min，42℃孵育60min；

70℃5min终止反应，反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。

4.2.1.3SOCS2基因编码区（CDS）的扩增

依照扩增CDS全长的引物设计原则，根据Genbank公布的SOCS2基因序列（NM_007706.3），用PrimerPremier5.0软件设计SOCS2扩增引物，表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。

表4-1SOCS2CDS区扩增引物

Table4-1PrimersofSOCS2CDSsequence

Primernames

Primersequence（5-3）

SOCS2-F：

CGTGTTGACTCATCTCCC

SOCS2-R

CATAGCTGCATTCGGAGA

SOCS2-F-BglⅡ

GCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGG

SOCS2-R-Flag-XhoⅠ

GCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT

TGTAATCTACCTGGAATTTATATTCTT

4.2.1.4SOCS2CDS区的扩增体系和条件

用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物，按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2CDS区。

表4-2SOCS2CDS区的扩增体系和条件

Table4-2PCRamplificationsystemand

10×

PCR缓冲液

1.25μL

dNTPMixture（各2.5mM）

上、下游引物（10μM）

各0.5μL

cDNA

1.3μL

ddH2O

7.45μL

瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：

预变性（95℃）

5min

反应一：

（20个循环）

变性（95℃）

40s

退货（62℃，每个循环降0.5℃，共20循环）

延伸（72℃）

50s

反应二：

退火（57℃）

反应三：

8min

反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4℃，-20℃可存放一周

4.2.1.6SOCS2CDS区的T载体克隆及鉴定

依照TakarapMDTM18-T克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMDTM18-T；

A.克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；

pMD18-T（50ng/μL）

插入的目的片段（0.1-0.3pmol）

3.5μL

dH2O

0.5μL

SolutionⅠ

5μL

B.瞬时离心，收集反应液。

16℃孵育过夜（>

12h）；

将连接产物10μL加入到100μLDH5α感态中，冰浴30min；

C.42℃热击45s，迅速冰浴1min，此过程不可激烈晃动PCR管，否则影响转化效率；

D.加入1mLLB无抗性培养液，37℃、200rpm震荡培养1h；

E.室温、4000rpm离心5min，收集菌体；

吸弃900μL培养液上清，用枪头吹打100μL余液，重悬菌体；

F.无菌条件下，将100μL菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板，37℃倒置培养；

E.培养约12h，无菌条件下，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中，37℃、250rpm震荡培养过夜，提取穿梭质粒进行PCR检测；

阳性克隆送至金斯瑞公司测序。

4.2.2DH5α感受态的制备（CaCl2）

无菌条件下，将冻存的DH5α划线接种于无抗性的LB固体平板上，37℃倒置、过夜培养，选取生长良好的单克隆接种于100mL无抗性的LB液体培养液中，于37℃、250rpm，震荡培养过夜（约16h）；

A.从中吸取1mL菌液接种于100mL无抗性的新鲜培养液，37℃、250～300rpm培养2～3h，从2h开始不断对菌液测ODλ=600值，直至0.4≤ODλ=600≤0.6（0.45为最适OD值）；

B.以下步骤必须均需无菌冰上操作，0.1MCaCl2和含15～20%甘油的0.1MCaCl2需要预冷处理；

C.取30mL菌液于50mL离心管，冰上冷却10min；

D.4℃4500rpm离心5min收集菌体；

加3mL0.1MCaCl2溶液，枪头轻轻吹打，使菌体悬浮，冰上放置20min；

E.4℃4500rpm离心5min，收集菌体；

加3mL含15～20%甘油的0.1MCaCl2，枪头吹打混匀菌体；

每100μL分装一管，-80℃冻存。

4.2.3质粒转化

A.-80℃冻存的感受态，冰上融化或室温融化后立即置于冰上；

B.向100μL感受态中加入连接产物（含量≤50ng，体积≤10μL），摇匀，冰上静止30min；

C.42℃水浴热激90s，或37℃水浴5min，热击后迅速置于冰上，静止5min；

操作过程不要有激烈摇动；

C.向离心管中加1mL无抗性LB培养基，混匀后，37℃250rpm振荡培养1h，细菌恢复正常生长，抗性基因开始表达；

D.将上述菌液4000rpm离心5min，弃去1mL上清，重悬菌体，菌液均匀涂于含相应抗性的LB固体平板，放置30min后，37℃倒置培养过夜。

4.2.4质粒的小量提取

挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中，37℃300rpm激烈振荡培养12~16h，获得的新鲜菌液依照OmegaE.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒，所有步骤均在室温下操作。

4.2.5重组穿梭穿梭质粒的构建

4.2.5.1SOCS2CDS区的PCR扩增和回收

以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板，表4-1中SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-Flag-XhoⅠ分别为上游和下游引物，按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2，所用引物带有所需要的酶切位点（下划线部分）和Flag标签（斜体部分）。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，切取含目的片段的胶块，按4.2.5步骤回收PCR产物，微量定量仪测定浓度待用。

4.2.5.2SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收

以微量定量仪测定的浓度为参照，按下列体系对目的DNA进行BglⅡ和XhoⅠ的双酶切，穿梭质粒酶切体系：

Buffer

pAdTrack-CMV（0.5～1μg/μL）

6μL

BglⅡ

0.6μL

XhoⅠ

dH2O

10.8μL

SOCS2PCR产物酶切体系：

SOCS2

11μL

15μL

瞬时离心收集反应液，37℃孵育5h，产物进行1%琼脂糖电泳，将酶切的获得的目的条带切下，按4.2.5步骤回收双酶切的DNA，测定浓度备用。

4.2.5.3SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接

将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度，目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:

1的摩尔比混合，T4连接酶连接，连接体系如下：

2.5μL

SOCS2CDS（约0.3pmol）

5.5μL

CMV（约0.03pmol）

0.7μL

T4连接酶（350U/μL）

15.3μL

瞬时离心收集反应液，16℃孵育过夜，取10μL连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿梭质粒转化DH5α感受态，于含Kan（100μg/mL）的固体LB平板，37℃倒置培养过夜。

挑取生长良好的单克隆，于含15mLKan（100μg/mL）的LB液体培养基，37℃摇菌过夜，培养液浑浊后，取800μL菌液甘油（15～20%）冻存备用，其余用于穿梭质粒提取和后期检测。

4.2.5.4重组穿梭质粒的菌落PCR鉴定

取10μL单克隆摇菌获得的菌液，用