蛋白纯化protocolWord文档下载推荐.docx
《蛋白纯化protocolWord文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白纯化protocolWord文档下载推荐.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
1）将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3）用大约5倍柱体积的BindingBuffer洗，流速控制在0.5-1ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化
4）分别用2－5倍柱体积的梯度ElutionBuffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。
流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。
待清楚纯化条件后，就可只使用2个咪唑梯度纯化。
5）确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
6）目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
三、柱材料处理
1）用大约10倍柱体积的StripBuffer洗，流速1ml／min。
2）用大约10倍柱体积的ddWater洗，流速1ml／min。
3）用大约10倍柱体积的ChargeBuffer上镍，流速1ml／min。
4）用大约5倍柱体积的ddWater洗，流速1ml／min。
5）用大约10倍柱体积的BindingBuffer平衡，流速1ml／min。
四、附件：
溶液配方
BindingBuffer
20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,5mM咪唑
ElutionBuffer
20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,1M咪唑
ChargeBuffer
50mMNiSO4（Nicl2）
StripBuffer
20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,100mMEDTA
离子交换层析法
离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
⒈离子交换剂预处理和装柱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；
对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为H+型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱
加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。
为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：
已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。
最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6。
两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。
⒊洗脱馏份的分析
按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。
依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、SDS－PAGE等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
⒋离子交换剂的再生与保存
离子交换剂可在柱上再生。
如离子交换纤维素可用2mol/:
NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；
若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：
0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。
凝胶层析
凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。
具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。
以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：
①分级分离各种抗原与抗体；
②去掉复合物中的小分子物质。
如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；
③分析血清中的免疫复合物；
④分子量的测定。
（一）原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
（二）葡聚糖凝胶的种类与性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。
葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。
商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。
由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
表1－8Sephadex1的种类与特性
型号
分离范围
（分子量）
吸水量
（ml/g）
最小溶胀时（h）
20℃～25℃100℃
床体积（ml）/干凝胶（mg）
G10
＜700
1.0±
0.1
31
2~3
G15
＜1500
1.5±
0.2
2.5~3.5
G25
＜5000
2.5±
4~6
G50
1500～20000
8.0±
0.3
9~11
G75
3000～70000
7.5±
0.5
241
12~15
G100
4000～15000
10.0±
1.0
721
15~20
G150
5000～800000
15.0±
1.5
721
20~30
G200
5000～300000
20.0±
2.0
30~40
G25、G50有四种颗粒型号：
粗（100µ
~300µ
）、中（50µ
~150µ
）、细（20µ
~80µ
）和超细（10µ
~40µ
）。
G75～G200又有两种颗粒型号：
中（40µ
～120µ
），超细（10µ
～40µ
颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。
表1－9DEAE－纤维素与Sephadex1比较
项目
DEAE纤维素
Sephadex
交换量
小
较大
非特异性吸附
分离纯度
较好
好
分离时间
较粗
较长
应用范围
较窄
较宽
预处理
繁琐
方便
（三）试验方法
1．凝胶的选择根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
2．凝胶的预处理称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定（见表1－10）。
表1－10凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
层析柱规格
凝胶的规格和用量（g）
直径（cm）
高（cm）
容量（ml）
0.9
15
9.5
2.5
1
0.6
30
19
5
2
1.2
60
38
10
4
1.6
20
40
80
8
5.0
2.4
70
140
35
14
9.0
4.4
100
200
50
12.5
6
2.6
210
12
7
370
90
530
1000
130
250
110
17
为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。
3．装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。
纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。
去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。
柱太短，影响分离效果。
柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。
层析柱的内径也要选择适当。
内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。
所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。
对于除盐来说应为1︰5～1︰25；
对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
4．加样与洗脱样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。
样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。
洗脱液要有一定的离子强度和pH值。
分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/LpH6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/LNaCl）和0.1Mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/LNaCl）。
5．洗脱液收集同离子交换层析。
6．凝胶柱的重复使用与保存当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。
保存方法
升级会员 