血清清蛋白γ-球蛋白的分离提纯与鉴定_精品文档.doc

血清清蛋白γ-球蛋白的分离提纯与鉴定_精品文档.doc

《血清清蛋白γ-球蛋白的分离提纯与鉴定_精品文档.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血清清蛋白γ-球蛋白的分离提纯与鉴定_精品文档.doc（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定

一、实验目的

1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；

2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；

3.了解柱层析技术。

二、实验原理

血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。

1．盐析

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：

表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。

盐析法的原理是：

中性盐如硫酸铵（（NH４）２SO4）等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。

由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。

2．脱盐

盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：

透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。

本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。

分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.纯化（离子交换层析）

离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。

血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。

4.纯度鉴定（电泳）

血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法：

以流程图示意

1.实验材料

人血清、葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25）层析柱、二乙基氨基乙基（DEAE）纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、0.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl2溶液、电泳仪、电泳槽。

2.实验方法

1）实验流程

纯化

鉴定

脱盐

粗提

DEAE纤维素离子交换层析

醋酸纤维素薄膜电泳

葡聚糖凝胶层析

盐析法进行粗分离

2）实验步骤

①　盐析：

中性盐沉淀步骤

步骤

操作

（1）盐析

取离心管一个，加入0.8mol人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀后室温下放置10min，离心10min（4000r/min）。

用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用

（2）溶解沉淀

向离心管的沉淀加入0.6mol蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化γ球蛋白用

注意：

上层清夜尽量全部吸出，但不可吸出沉淀物。

②　脱盐：

过凝胶层析柱步骤

步骤

操作

（1）调节层析柱液面

葡萄糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液流洗平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面

（2）加样品

用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱下端用10ml刻度离心管接液，拧松柱下螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床表面为止

（3）洗层析柱

小心用0.02mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液

（4）洗脱

待样品液进入凝胶床内，继续用0.02mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液流洗，同时注意流出液量

（5）检测及收集蛋白质

在黑色反应板凹孔内加2滴0.92mol/L磺基水杨酸，随时检查流出液是否含有蛋白质，①滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流出（当凝胶床体积为5.5ml时，流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。

②收集约12滴后，滴流出液1滴于预先加有1滴0.05mol/L（1%）BaCl2的黑色反应板凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有SO42-），立即停止收集

收集的蛋白质溶液即可分别过DEAE纤维素柱，进行离子交换层析

（6）层析柱再生平衡

收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液流洗，用BaCl2液检测层析柱流出液，当流出液用BaCl2检查SO42-为阴性后，继续洗涤2~3ml。

凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用

注意：

a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。

b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。

C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。

d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。

e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避免损耗，严禁倒掉。

③　球蛋白的纯化：

过DEAE纤维素阴离子交换层析柱

步骤

操作

（1）调节层析柱换冲液面

经处理再生好的DEAE纤维素层析柱，取下其恒压储液瓶管塞。

小心控制柱下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面。

柱下端用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体的流出量。

（2）加样品

将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止。

（3）析层析

小心用1ml0.02mol/LPH6.5的醋酸铵缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液。

（4）洗脱

待样品进入纤维素柱床内，继续用0.02mol/LPH6.5的醋酸铵缓冲液流洗，。

同时注意流出液量

（5）检测及收集蛋白质

流洗时，随时用0.92mol/L磺基水杨酸检查流出液中是否含蛋白质（方法同前）当有蛋白质出现时，立即连续收集三管，每管10滴，。

此不被DEAE纤维素吸附的蛋白质即为纯化的γ-球蛋白，取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴定用。

注意：

a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。

b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。

C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。

d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，特别是收集伽马球蛋白时。

④　清蛋白的纯化：

过DEAE纤维素阴离子交换层析柱

步骤

操作

（1）调节层析柱缓冲液面

此时DEAE纤维素层析柱不必再生，可直接用于纯化清蛋白

小心控制住下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面，柱下端用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体流出量

（2）加样品

将除盐后收集的清蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹，使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止

（3）洗层析柱

将除盐的粗制清蛋白溶液上柱后，改到0.06mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液洗脱

小心用1ml0.06mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液

（4）洗脱

待样品进入纤维素柱床内，继续用0.06mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液流洗。

同时注意流出液量。

流出约6ml（其中含α-球蛋白及β-球蛋白）后，将柱上的缓冲液面降至与纤维素表面平齐。

改用0.3mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液洗脱

（5）检测及收集蛋白质

用0.92mol/L（20%）磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质（方法同前）。

由于纯化的清蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉眼可见一层浅黄色的成分被0.3mol/L、pH6.5NH4AC缓冲液洗脱下来，大约改用0.3mol/LNH4AC缓冲液洗脱约2.5ml时，即可在流出液中试出有蛋白质出现，立即连续收集2管，每管10滴，此即为纯化的清蛋白液，留作纯度鉴定用

（6）纤维素层析住的再生与平衡

用过的DEAE纤维素层析柱，应重新再生平衡

先用约6ml1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用0.02mol/LpH6.5NH4AC液约10ml流洗平衡即可

注意：

a.当层析柱的缓冲页面或样品页面刚好下降到纤维素膜表层时，不要是液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。

b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。

C.使用时切勿将各时段所用的溶液浓度搞混。

d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。

⑤　纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）

步骤

操作

准备

电泳槽准备：

将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲溶液，使其在同一水平a，页面与支架距离2~2.5cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥

薄膜准备：

将醋酸纤维薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在薄膜一段1.5cm处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线，末端用铅笔做记号。

进入巴比妥溶液中直至浸润完全。

用镊子青青取出，粗面朝上，平放在两层干滤纸中间，轻轻拭去多余的缓冲液。

点样

薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上，粗面朝上，用玻片或载玻片一段的截面在盛有样品的直接沾取2~3微升待测品，让后将样品与薄膜点样先轻轻接触，均匀分布在点样线上，带样品渗入薄膜后移开，四种样品分别点样。

电泳

将已点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的电泳槽上，点样面朝下，点样端至阴极，轻轻拉平薄膜。

平衡约5min，使缓冲液渗透大道平衡。

接好电路，调节电压开始电泳。

待各个样品没有变化停止电泳，并轻轻取出。

染色漂洗和鉴定

将染色液倒入大培养皿中，电泳完毕后用镊子取出薄膜，直接浸入染色约5min。

后将薄膜取出，漂洗至背景无色，观察电泳情况得出结论。

四、结果与讨论：

①结果：

实验数据、现