基因工程制药复习Word格式.docx

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cDNA的受体菌群体，称为该生物cDNA文库。

7.基因工程药物：

指利用基因工程技术研制和生产的药物，主要包括重组蛋白（多肽）

药物、反义核酸药物、DNA药物和基因工程抗体等。

8.盐析

盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。

9.星活性

星号（*）活性：

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些

核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。

EcoRI*代表EcoRI的星号活力。

星活性的特点：

限制酶识别序列特异性降低

例如：

EcoRI（高pH值或低盐离子强度）

5’GAATTC3’变成5’NAATTN3’，另有一种情况是对AATT中的A、T分辨不严格。

二、简答题

1.如何克隆微生物的纤溶酶基因？

PCR法分离目的基因：

根据核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。

根据已知探针克隆基因：

首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体（质粒、噬菌体或病毒）中作序列测定或功能分析。

这种方法不但可以将基因克隆出来，还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。

但在探针杂交后，要注意高强度漂洗，以避免干扰信号，即保证克隆的特异性，同时节省时间。

用特异抗体克隆基因：

在获取理想的抗体后，可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA 

文库，从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆出来。

若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，则PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。

2.获得目的基因的途径有哪些？

一、化学合成法

（一）化学合成法的单元操作

从反应机理上分为：

磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法

操作过程：

液相合成、固相合成

化学合成一般由专门的公司完成，也可以通过基因合成仪自己完成。

（二）基因组装战略

1、小片段粘接法：

根据目的基因全序列，分别合成12~15碱基长的单链DNA小片段。

预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之间的互补区域能形成有断点的完整双链。

2、补丁延长法：

根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12~15碱基长的单链DNA

小片段以及20~30碱基长的单链DNA中片段。

预先设计合成的短片段与长片段的某段序列互补。

3、大片段酶促法：

根据目的基因的全序列，分别合成40~50碱基长的单链DNA片段。

预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作为另一个片段延长的引物。

（三）DNA化学合成的用途

⏹合成天然基因：

胰岛素基因、干扰素等

有些基因比较短，化学合成费用较低。

⏹修饰改造基因，设计新型基因

“人造儿”

2010，5.20，美国64岁科学家10年耗资4000万美元用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因后导入到支原体细菌，DNA象正常细菌的基因一样进行复制——人造生命诞生。

⏹制备探针、引物、接头

⏹定点突变合成：

合成带有定点突变的基因片段

二、PCR技术（多聚酶链式反应）获得目的基因

缺点：

DNA聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加DNA聚合酶。

1、已知序列基因的分离

（1）已知序列是DNA片段

根据研究的目的，通过已知DNA序列设计相应引物，直接利用PCR方法进行分离。

根据已知序列克隆基因

⏹对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。

⏹目前，世界上主要的基因库有：

⏹EMBL，为设在欧洲分子生物学实验室的基因库

⏹Genbank，为设在美国国家卫生研究院（NIH）的基因库

⏹Swissport和TREMBL，Swissport是一蛋白质序列库，其所含序列的准确度比较高，而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列

（2）若已知基因的mRNA序列，如何克隆该基因？

⏹首先要分离（或纯化）mRNA

⏹A：

根据mRNA序列直接设计引物

⏹B：

根据mRNA序列设计一条引物和OligoT/A引物进行PCR扩增

⏹C：

逆转录，以获得的cDNA为模板，进行PCR扩增

⏹……

2、未知序列基因的分离

（1）序列在其他物种上已有报道

具体做法：

⏹首先找出上述几个物种的PDS基因序列，进行比对

⏹寻找出其保守序列，根据保守序列设计引物（或简并引物）

⏹PCR扩增（DNA或RNA为模板）

如何根据蛋白序列克隆基因？

（2）已知部分序列，但不完全

可采取RACE技术

cDNA末端快速扩增技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法。

3’RACE原理

利用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。

然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。

5’RACE原理

先利用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。

利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3~5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。

然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2

（GSP2）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。

最终，从2个有相互重叠序列的3’/5’-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3’和5’端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。

（2）序列未报道

反向PCR：

根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术。

TAIL-PCR，即交错式热不对称PCR，是一种染色体步移技术。

⏹根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物，与经过独特设计的退火温度较低的兼并引物（可以设计多条），进行热不对称PCR。

⏹通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，一般通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。

⏹如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。

随着基因组测序技术的发展，以PCR途径获得目的基因的重要性更加突出！

三、基因文库法获得目标基因

基因库：

特定生物体全基因组的集合（天然存在）。

每个种群都具有其独特的基因库。

基因文库：

通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA保存于适当宿主菌中形成的转化子群。

所有重组DNA组合代表该基因组的全序列。

根据构建方法的不同，基因文库分为：

基因组文库和cDNA文库

（一）基因文库的容量和完备性

在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：

N=ln（1-P）/ln（1-f）

P=任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率

F=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小

影响因素：

基因组大小、目的基因在基因组中的拷贝数、克隆载体的容量及目的基因的大小

基因文库的完备性：

在构建的基因文库中任一基因存在的概率。

完备性越高，文库容量越大。

例：

人的单倍体DNA总长为2.9×

109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；

而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。

（二）理想基因文库条件

1、完备性高，筛选任一基因的概率均应为99%

2、重组克隆的总数不宜过大

3、载体的装载量最好大于基因的长度

4、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域

5、克隆片段易于从载体分子上完整卸下

6、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选

（三）基因组文库及其构建程序

基因组文库：

包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体中，这个群体称为这种生物的基因组文库。

文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖该生物的整个基因组。

基因组文库的构建程序

1、基因组DNA的制备和切割（保证DNA片段之间存在部分重叠；

DNA片段大小均一）

超声波处理；

限制性内切酶部分酶切

2、载体和受体的选择

载体：

λ-DNA或cosmid质粒，大型基因组使用YAC或BAC

受体：

大肠杆菌或酵母菌

3、DNA片段和载体的相连

直接连接、人工接头或同聚物加尾

4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基因组文库的初库

5、初库扩增形成终库

把培养皿上的细菌全部洗下加以保存

（四）cDNA文库

定义：

某生物mRNA反转录产生cDNA片段分别与合适的克隆载体相连，通过转化贮存在一种受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体，称为该生物cDNA文库。

cDNA文库的特点是什么？

（1）不含内含子序列；

（2）可以在细菌中直接表达；

（3）包含了所有编码蛋白质的基因；

（4）比DNA文库小，容易构建

（五）从文库中筛选目的基因

探针法：

杂交；

阳性克隆；

质粒提取纯化；

酶切或测序验证

PCR法：

设计引物；

PCR；

电泳检测；

其他方法

四、转座子标签法获得目的基因

转座子：

指位于染色体上可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的DNA片段或基因。

转座子标签法获得目的基因流程

五、图位克隆获得目的基因

Ø

图位克隆：

又叫定位克隆

根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。

可通过染色体步移技术逐步逼近目标基因。

六、mRNA差别显示技术获得差异表达的基因

mRNA差别显示技术：

对组织特异性或诱导专一性表达基因进行分离的有效方法之一。

将mRNA逆转录和PCR技术相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，也称为DDRT-PCR。

七、酵母双杂交系统分离目的基因

酵母双杂交系统：

将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域和GAL4激活结构域，构建成融合表达载体，从表达产物分析