目的基因的克隆转化及重组子筛选_精品文档.doc

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实验报告

题目:

单元二:

目的基因的克隆、转化及重组子筛选

指导老师:

丛佩清

日期:

2013/10/24-2013/10/26

一．实验目的：

（1）学习和掌握DNA片段胶回收的方法。

（2）学习DNA连接的有关技术。

（3）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

（4）学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。

（5）掌握质粒提取的基本方法。

（6）学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

二．实验原理：

（1）cDNA的TA克隆:

Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为T-A克隆。

可用于PCR产物的克隆和测序。

（2）感受态细胞制备原理：

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。

（3）蓝白斑筛选:

载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。

诱导物IPTG和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。

可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。

三．实验材料：

大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/LCaCl2溶液、BindingBuffer、spin-column、SPW溶液、1µlpMD19-TVector、5µlSolutionⅠ、250µlSolutionⅠ、250µlSolutionⅡ、350µlSolutionⅢ、HiBind®MiniColumns（I）、500µlBufferHB、1400µlDNAWashBuffer等

四．实验步骤、现象、结果及分析：

Ⅰ10月24号

（1）cDNA电泳及胶回收

1.取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loadingbuffer）分别加入SYBRGold2µl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。

2.把所割胶放入1.5mlEP管，称重如下表一。

表一：

cDNA琼脂糖凝胶重量

空管

2管

3管

重量（g）

0.9045

1.2280

1.2961

净重（g）

0.3235

0.3916

3.按1g/1ml的量，大致各加入400µlBindingBuffer，65℃水浴7min；（每隔2－3min，摇一下）；

4.把溶液转移至spin-column，10000g离心1min，倒出套管内残液；

5.在柱子中加入300µlBindingbuffer，10000g离心1min，倒出套管内残液；

6.在柱子中加入700ul的SPW溶液，放置3min，10000g离心1min，去残液；

7.10000g离心1min（去乙醇）；

8.把柱子放入干净的1.5mlEP管。

加ElutionBuffer20µl。

室温放置1min，10000g离心1min。

9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。

选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。

表二：

cDNA吸光度测定

2组

3组

A260/A280

1.864

1.867

浓度（ng/µl）

146.718

128.242

（2）感受态细胞制备

1.从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中，37℃剧烈振荡培养过夜（教师准备）。

2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a按1：

50取1ml菌液接种到50mlLB培养基中，37℃振荡培养，1hr后用分光光度计测其OD值为0.182，1.5hr后再测其OD值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期OD600为0.2-0.4）。

3.分别取1ml菌液至1.5ml离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置10min，5000r/min，离心2min，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。

4.分别加入500µl预冷的0.1mol/LCaCl2，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的CaCl2中，冰上放置10分钟。

5.离心机5000r/min，离心2min，用枪头吸取弃上清，分别加入100µl预冷的0.1mol/LCaCl2，小心用枪头吹散，0℃保存3hr。

（3）连接和转化

组别

实验组

正对照组

负对照组

操作

连接：

从2号胶回收DNAEP管中取4µl，加入1µlpMD19-TVector、5µlSolutionⅠ组成10µl连接反应体系，在16℃下进行连接反应；

转化：

30min后加入1号100µl感受态细胞EP管中，以手指轻轻触碰混匀，冰中放置30min进行转化，接着42℃热激45sec，再在冰中放置1min，最后加入390µlLB液体培养基于37℃振荡培养50min。

取1µl（5ng/µl）质粒加入2号100µl感受态细胞EP管中。

无需取任何物质加入3号100µl感受态细胞EP管中。

样品组-100µl：

从上述500µl体系中取100µl加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。

样品组-200µl：

从上述500µl体系中取200µl加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。

从上述101µl体系中取50µl加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。

从上述100µl体系中取100µl加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。

注：

LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制：

取固体LB培养基于微波炉中融化，在超净工作台中冷却至55℃左右，加入80µl氨苄青霉素，混匀，倒入四个已消毒并做好标记的平板，分别是：

样品组100µl、样品组200µl、正对照组、负对照组，然后在遮光条件下分别用三角玻璃棒涂布X-Gal40µl和IPTG10µl。

Ⅱ10月25号

（1）取出过夜培养的4个平板，拍照并计数。

结果如下图所示：

图一：

样品组-100µl

图二：

样品组-200µl

图三：

正对照组

图四：

负对照组

从上述四图可以看出，图三正对照组出现大面积蓝色菌落，证明空载质粒转化成功，平板边缘菌落呈白色，是因为LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制时是使用三角玻璃棒涂布X-Gal，导致边缘不含或少含X-Gal。

图四负对照组无菌落出现，因培养基中含氨苄青霉素，而感受态细胞无抗性，因而不能生存。

图一样品组-100µl出现白色和蓝色菌落，证明重组质粒转化成功，图二样品组-200µl也出现白色和蓝色菌落，但密度比图一高。

白色菌落密度偏高（与其他组相比）的原因：

空载质粒的摩尔数==3×10-15mol

插入DNA片段的摩尔数==1.933×10-12mol

空载质粒的摩尔数：

插入DNA片段的摩尔数≈1:

1000，该比值远小于1:

2到1:

10的范围，待插入DNA片段过多，当时未稀释待插入DNA，直接进行了转化实验，导致重组白色菌落密度偏大。

对图三正对照组蓝色菌落进行计数，将平板划均分为8块扇形，计数2块扇形部分内菌落数分别为850、650，平均为750，总计6000，空载质粒转化效率计算如下：

1µl5ng/µl即5ng的质粒加入2号100µl感受态细胞EP管中，取50µl加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共计6000，此时转化效率=6000cfu/5ng=2.4×103cfu/ng=2.4×106cfu/µg质粒

（2）在超净工作台中，从样品组-100µl中用牙签挑取白色阳性菌落接种于400µlLB-amp培养基中，挑选4个菌落，分别接种于1号、2号、3号、4号试管中，于37℃振荡摇菌5hr。

（3）配制10µl反应体系，进行PCR。

10µl反应体系如下：

菌液DNA2µl

引物1（10µM）0.4µl

引物2（10µM）0.4µl

2×PCRReactionMix5µl

Taq聚合酶（2.5U/µl）0.2µl

超纯水2µl

由于全班共配置100个反应体系，每组50µl，从老师处领取后，自行分装8µl/管，分别标号1、2、3、4，再对应上午振荡培养的1号、2号、3号、4号菌液培养EP管并从中取出2µl作模板加入，后进行PCR反应。

PCR反应条件如下：

94℃变性3min；

94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环；

72℃10min。

（4）电泳：

桌面薄膜依次点上marker及1、2、3、4号PCR产物各4µl，再分别加入1µlSYBRGold，充分混匀，于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。

（5）电泳完毕，取出凝胶，在紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成像系统中拍照并保存之，电泳照片如下图五所示：

Marker1234

bp

2000

1000

750

500

250

100

图五：

菌落PCR产物电泳示意图

由上图可以看出，1、2、3、4号重组白色菌落PCR产物条带均在600bp左右，证明转化成功。

（6）随机从1号、2号、3号、4号菌液培养EP管中选取1号、2号，将菌液倒入1号、2号3mlLB-amp培养管中，37℃摇床过夜培养。

Ⅲ10月26号

（1）质粒提取：

1.取出过夜培养15hr的1号、2号试管，分别从中取1.5ml的菌液加入1号、2号EP管，于室温下10，000xg离心1min以沉淀菌种，由于菌液超过3ml，本实验步骤重复2次。

2.倒出培养基，往沉淀中加入250µlSolutionⅠ/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。

3.往重悬混和液中加入250µlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀7次。

避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。

4.往上述混和液中加入350µlSolutionIII，温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。

室温下，13，