ABI3500xL基因分析仪操作流程Word下载.docx
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使用EdgeBio收集柱进行纯化。
(1)离心850g,3min柱子,弃掉收集管,换新的EP管。
(2)将待纯化样品加到柱子中间,注意不要加到离心柱侧壁上。
(3)离心850g,3min,弃掉柱子,即得纯化产物。
(4)取10µ
LHi-DiFormamide加入96孔板中,再加入10µ
L待测样品,振荡混匀离心。
(二)PCR产物测序标准实验流程
1.对PCR产物的要求
纯度:
OD260/OD280=1.6~2.0,用量:
每反应10~100ng。
强烈建议在测序前,先纯化PCR产物。
2.PCR产物的测序PCR反应
方法同上。
二、上机测序
(一)启动系统
1.打开电脑,检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。
2.打开3500xL仪器电源,等待仪器自检,指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。
3.启动电脑桌面Datacollectionsoftware。
4.检查维护提醒:
浏览维护提醒,若已完成点击。
5.检查耗材状态:
点击“Refresh”,更新后检查仪表盘上各种耗材的状态(POP7、ABC、CBC
6.
7.
1.点击屏幕下方的AssignPlateContents。
(1)输入各个孔的样品名称等信息,Resultsgroup:
输入结果的保存路径。
(2)选中下面控制面板上Assay,Filenameconvention,Resultsgroup三个项目。
(3)点击LinkPlateforRun→OK。
2.检查屏幕上显示的各种信息,确定正确无误后点击StartRun,即启动运行。
(四)监控运行
仪器正在运行时,可在软件中监控运行情况。
1.可查看选中的单孔或某一排的运行情况,查看InstrumentRunViewsandFlags中各项:
EPT(电流、电压、温度),Array中可查看峰图。
2.可编辑进样列表:
重复进行,改变次序,删除进样,终止进样等操作。
3.启动、暂停或继续运行。
(五)查看结果
点击ReviewResults即可查看原始的测序结果,分析结果方法见下。
三、分析测序结果
1.打开软件:
双击电脑桌面SequencingAnalysisv5.4图标。
2.导入结果:
点击工具栏中Addsamples按钮,选择路径,导入待分析的测序结果。
3.分析:
Samplemanager中选择分析方法对测序结果进行分析。
一般用BC(baseclling,将原始结果翻译为对应的碱基序列)。
(1)选中BC复选框,点击工具栏中Startanalysis按钮,即开始分析。
(2)分析结束后,结果将自动保存为ab1格式文件。
(3)点击工具栏中Analysisreport按钮,可查看结果状态(BCstatus),不同颜色代表不同测序结果,可判定本次测序成功与否。
(4)选中某样品前show复选框,即可查看各样品的详细结果。
A.sequence显示碱基序列及其QV评分结果。
注意:
a.蓝色:
HighQV=20+,结果可信;
黄色MediumQV=15to19,需查看峰图,判定结果是否可信;
红色LowQV≤15,结果不可信。
b.此处可选中序列,右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。
B.Electropherogram显示电泳峰图及序列。
C.Raw显示看到原始电泳图。
4.打印:
Samplemanager中选中P(print)复选框,点击Startanalysis绿色按钮,即可将测序结果输出为pdf格式文档。
操作注意事项
1.测序反应:
(1)模板:
测序反应对模板质量要求很高,一般需经纯化才可使用;
模板用量也有规定。
(2)反应体系:
一般用标准的反应体系,也可用稀释反应体系(比如序列比较简单时),一般8倍以内稀释比较可靠。
(3)反应条件:
退火50℃和延伸60℃时,升降温速度需降低至1℃/s,使测序反应充分进行。
(4)体系配制:
反应体系的制备不能在样品制备区和PCR区进行,移液器不能混用,否则会造成实验室污染。
ABI3500xl日常维护
1.毛细管维护:
(1)每周查看阴极缓冲液的液面,避免毛细管露出液面干燥而失效。
若液面下降,可在阴极缓冲液中加入双蒸水,保证毛细管插入液面下。
下次电泳前换新的缓冲液。
(2)防止碰触毛细管针尖,只有在更换新的毛细管时才需打开检测窗口门,之后需在软件中重新校正。
包括:
A空间校正,maintainance→calibrate→speitial,选择fill灌胶后开始,选择nofill不灌胶直接开始→startcalibrate。
结果判定,所有峰只有一个尖且间距在15,16间,峰高比较均一,相差不超过60%,可接受,完成后要点Accept或者reject。
B光谱校正,换新毛细管、不同类型试剂盒、不同类型胶时需做maintainance→calibrate→spectial,G5为片段分析用,Z为测序用→calibraterun,chemistrystandard:
G5。
完成后需点Accept。
(3)若长期不用仪器时,仍需每周给毛细管灌胶一次。
(fillarraywithpolymer)
2.仪器日常维护:
(1)可用无尘纸巾、棉签和蒸馏水擦拭仪器表面,勿使用有机溶剂,不能随意搬动仪器。
(2)严禁在电脑上安装其他无关软件,不准用U盘拷贝数据,只能刻盘。
(3)长期不用应将POP7胶取下加塑料塞放入4℃冰箱,用漂洗袋代替。
并每周进行一次replenishpolymer。
(换新胶袋后和每周一次)。
(4)若机器使用频繁应每周用contridationingregents清洗灌胶泵(washpumpandchannels)
一次。
(5)fillarraywithpolymer,换毛细管后或认为灌胶有问题时重新灌。
(6)shutdown,长期不用时关闭仪器,慎用。
(7)removebubbles,排气泡。
(8)灌胶泵维护每月一次:
A,水峰,松开泵上方进口旋钮,用注射器注射纯水5-10ml,要缓慢注射,洗去水峰中的杂质,结晶。
B,拆掉buffer,胶时可手动洗泵,从泵下方进胶处注射入纯水,也可contridationingregents洗泵。
4.操作注意:
(1)操作时必须戴手套。
(2)Hi-DiFormamide为变性剂,操作时需注意安全。
(3)仪器运行时不能打开仓门,软件运行时勿进行其他软件的操作。